[发明专利]一种以宣木瓜细胞培养法制备化合物齐墩果酸的方法

摘要

本发明公开了一种以宣木瓜细胞培养法制备化合物齐墩果酸的方法，首先以宣木瓜茎段为外植体接种MS固体培养基，于25±1℃条件下诱导愈伤组织，然后通过诱导出的愈伤组织的继代，优化培养，使愈伤组织达到疏松旺盛的状态，适合悬浮培养。再将优化后的愈伤组织接种在MS液体培养基中进行悬浮培养，再次通过优化，得到生长旺盛，次生代谢物质较高的培养条件，经分离提纯得到齐墩果酸。培养物中齐墩果酸含量达6.88％，高于宣木瓜成熟果实中的含量。本发明方法具有培养周期短、效率高、对环境无污染等特点。

主权项

一种以宣木瓜细胞培养法制备化合物齐墩果酸的方法，以宣木瓜茎段为起始原料，包括宣木瓜愈伤组织的诱导、愈伤组织继代优化培养和细胞悬浮培养以及齐墩果酸的分离和提取，包括以下步骤：(1)培养基的配制配制MS固体培养基，每升蒸馏水加入6‑8g琼脂，30‑32g蔗糖，1mg2，4‑D，0.5mg KT，调节培养基pH在5.5‑6.0之间，分装于100ml的三角瓶中，每瓶25ml左右，然后进行高压消毒，压力为1.0‑1.5Kg/cm2之间，时间为18‑22分钟；(2)以宣木瓜茎段为材料，用75％的酒精浸泡4‑6s，随后转移至0.1‑0.12％升汞溶液中进行表面消毒6‑10min，将茎段切成0.8‑1.2cm小段，接种于已配制的MS固体培养基上，培养温度为24‑26℃，经过15～20d左右的培养，在切口处获得较多的愈伤组织；(3)将诱导出的愈伤组织从母体分离，对其进行继代培养，温度24‑26℃，通过调节不同糖浓度、不同pH值、不同培养条件等对愈伤组织的培养进行优化，每次调控的周期为三周左右，5‑8次继代后，获得颜色为浅黄色的疏松的愈伤组织，此时的愈伤组织可建立悬浮细胞体系；(4)细胞悬浮培养以多次继代后所得的宣木瓜疏松愈伤组织为试验材料，接种于MS液体培养基进行悬浮培养，分装于250ml三角瓶中，每瓶装液量为95‑100ml，接种量为3‑5g，接入培养瓶后放入恒温的悬浮振荡器，培养条件为：温度24‑26℃，摇床转速110‑120转/分钟，培养20‑22天；通过调节不同的碳源，不同起始pH值，不同激素等对悬浮培养条件筛选优化；其中，所述的MS液体培养基的配制和步骤(1)所述的配制MS固体固体培养基相同，只是不加琼脂；(5)分离提取齐墩果酸悬浮后获得的细胞悬浮液，对其进行抽滤，收集滤纸上面的新鲜愈伤组织，置于60℃烘箱烘干至恒定质量进行研磨；称取愈伤粉1g置于三角瓶中，加入95％乙醇25ml，混合，在超声条件下提取30min，蒸馏回收溶剂，得到的浸膏状的物质用水和氯仿洗涤几次，合并洗涤液，弃水层，蒸馏氯仿，获得齐墩果酸用无水乙醇溶解并定容至25ml，然后对其用紫外分光光度计进行分析测定。