[发明专利]白细胞介素6基因重组逆转录病毒载体的构建方法

摘要

本发明公开一种白细胞介素6基因重组逆转录病毒载体的构建方法，其步骤如下：（1）白细胞介素6（IL-6）基因片段的扩增；（2）重组pSEB-rIL6逆转录病毒质粒的构建和鉴定；（3）重组pSEB-rIL6逆转录病毒质粒在真核细胞中表达功能的测定。本发明所构建的逆转录病毒pSEB-IL6质粒可作为真核表达载体，能够感染多种类型的细胞，既可以应用于体外培养的细胞，也可以用于整体实验动物，应用范围广，感染效率高；所采用的载体-逆转录病毒是改造后的一种安全的病毒，该载体不仅带有组蛋白标签，实时检测表达水平；而且可以整合入宿主细胞中，随着细胞的不断分裂而持续表达；构建过程中所需设备要求不高，逆转录病毒载体的理化性质稳定，在制备、储存和应用过程中简单易行，适合推广应用。

主权项

白细胞介素6基因重组逆转录病毒载体的构建方法，其步骤如下：（1）白细胞介素6（IL‑6）基因片段的扩增；通过逆转录‑聚合酶链反应（RT‑PCR）方法，以大鼠骨髓间充质干细胞cDNA为模板，分别在上游引物的5’端和下游引物3’端设计HinDⅢ和BamHⅠ限制性内切酶酶切位点（斜体下划线为酶切位点），即 上游引物5’‑ ATCAAGCTT ACCACCATGGGC ATGAAGTTTCTCTCCGC‑ 3’上游引物5’ ‑CGT GGATCC GGTTTGCCGAGTAGACCTCATAGTGAC‑3’touch down PCR扩增获得IL‑6目的基因片段rIL6；（2）重组pSEB‑rIL6逆转录病毒质粒的构建和鉴定；采用pSEB逆转录病毒载体系统, 该系统具有组蛋白标签、hEFH启动子及开放读码框（ORP）；hEFH启动子可有效启动插入ORP中靶基因的高效表达，同时3组6个连续组蛋白可以作为检测标签，反映ORP中插入靶基因的表达水平；将步骤（1）中所获得的基因片段rIL6的PCR产物及逆转录病毒载体pSEB‑3H分别经HinDⅢ和BamHⅠ双酶切，连接转化进入DH2a感受态菌中，通过氨苄青霉素筛选单克隆，获得具有IL‑6重组的逆转录病毒质粒pSEB‑IL6，并进行PCR、双酶切及序列鉴定；（3）重组pSEB‑rIL6逆转录病毒质粒在真核细胞中表达功能的测定；针对步骤（2）所获得正确序列的逆转录病毒pSEB‑IL6质粒在真核细胞中的表达应用,利用脂质体转染系统，将步骤（2）中所获得的逆转录病毒pSEB‑IL6质粒分别转染到大鼠嗜铬细胞瘤PC12细胞和人胚肾细胞HEK293中，mRNA水平和蛋白水平测定IL‑6的表达水平。