[发明专利]一种农杆菌介导的油菜大田转基因方法

摘要

本发明公开了一种农杆菌介导的油菜大田转基因方法。用蔗糖、Silwet-77、乙酰丁香酮和6-BAP浓度分别为5％、0.05％-0.1％、0.2％-0.4％和0.001‰-0.002‰的1/2 MS液体培养基洗脱YEB固体平板上的农杆菌；转化前当油菜的主枝和部分侧枝出现花蕾并有几朵小花开放时，去除主花序和每个分枝花序已开放的花朵，只剩下花蕾；将花序在洗脱的转化菌液中浸泡30秒后立即包扎；同一花序连续浸染3次，间隔2-3天；转化后的7-10天，摘除花序上的羊皮纸袋和花序顶端的花及花蕾。该方法操作简单，所需成本降低，转基因效率高，无基因型依赖性，在利用基因工程手段培育油菜新品种和油菜突变体库建立方面都具有很好的应用前景。

主权项

一种农杆菌介导的油菜大田转基因方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)农杆菌转化菌液配置将活化的阳性克隆农杆菌菌液，稀释涂布在YEB固体平板上培养；在1/2MS液体培养基中依次加入蔗糖、Silwet-77、乙酰丁香酮和6-BAP，使其质量终浓度分别为5％、0.05％-0.1％、0.2％-0.4％和0.001‰-0.002‰，最后用NaOH调节pH值为5.7-5.8；配置成转化液；用配置的转化液将固体平板上的农杆菌洗脱下来，并继续用转化液将洗脱的转化菌液OD500的值调至0.6-0.8；(2)农杆菌转化菌液浸染油菜花序①转化前预处理当油菜的主枝和部分侧枝出现花蕾并有几朵小花开放时，去除主花序和每个分枝花序已开放的花朵，只剩下花蕾；②浸染将①步中经过预处理的油菜花序抓成一束，轻轻伸入转化菌液中充分浸泡花序，时间为30秒，浸泡后的花序立即用羊皮纸袋包扎；400-500ml的转化菌液浸染6-8株油菜；同一花序连续浸染3次，间隔时间为2-3天；(3)浸染后植株的管理在完成最后一次转化的7-10天后，摘除花序上的羊皮纸袋和花序顶端的花及花蕾；待种子成熟后，收获晒干，即得T1代种子；(4)转基因植株的筛选将获得的T1代种子播种，通过喷施除草剂抗性选择标记筛选。