[发明专利]抗磺胺类兔单克隆抗体的制备方法及其用途

摘要

本发明公开了一种抗磺胺类兔单克隆抗体的制备方法及其用途。本发明选取磺胺嘧啶与磺胺甲恶唑两种磺胺药物，分别与载体蛋白牛血清白蛋白偶联合成免疫抗原，混和两种免疫抗原，采用背部皮下注射免疫兔子，经过杂交瘤技术，最终得到抗磺胺类兔单克隆抗体。本发明制备的抗体为兔单克隆抗体，兔单克隆的制备优于鼠单克隆抗体。兔子相比于小鼠可以识别更多免疫抗原的表位。其次，兔脾脏较大可以进行更多的融合实验，使高通量筛选融合细胞成为可能。本发明生产的抗磺胺类兔单克隆抗体对磺胺甲恶唑、磺胺噻唑、磺胺嘧啶和磺胺吡啶有很好的检测效果，具有一定的广谱性。可用于食品、饲料及环境样品中磺胺类药物的残留检测。

主权项

一种抗磺胺类兔单克隆抗体的制备方法，其特征在于它的步骤如下：1)将10mg磺胺甲恶唑加入到2ml的1mol/L HCL中，70℃加热溶解，冰浴冷却后，滴加到0.4ml的0.2mol/L NaNO2，反应30min，得到重氮化的磺胺甲恶唑；将25mg牛血清白蛋白溶解于2ml的0.05mol/L碳酸盐缓冲液中，得到牛血清白蛋白溶液，重氮化的磺胺甲恶唑滴加到预冷后的牛血清白蛋白溶液中，用2mol/L NaOH调节pH值至9.0，4℃磁力搅拌6h，用磷酸盐缓冲液4℃搅拌下透析，得到磺胺甲恶唑免疫抗原，‑20℃存放；2)将磺胺嘧啶40mg溶解于1M的NaOH中，加入1ml的1％NaNO2，得到磺胺嘧啶溶液，冰水浴，磁力搅拌下，将磺胺嘧啶溶液滴加到2.4mL的1mol/L HCL中，反应10min，得到重氮化的磺胺嘧啶；将100mg的牛血清白蛋白，溶解于8mL，0.05mol/L碳酸盐缓冲液中，得到牛血清白蛋白溶液，将重氮化的磺胺嘧啶滴加到牛血清白蛋白溶液中，用NaOH调节pH值到9.5，4℃磁力搅拌6h，用磷酸盐缓冲液4℃搅拌下透析，得到磺胺嘧啶免疫抗原，‑20℃存放；3)将磺胺甲恶唑免疫抗原和磺胺嘧啶免疫抗原，采用背部皮下注射混和免疫兔子，免疫前取血2ml，第一次免疫将两种免疫抗原各0.5mg与等量弗氏完全佐剂混和后进行免疫，第二次至第五次免疫将两种免疫抗原各0.25mg与等量弗氏不完全佐剂混和后进行免疫，免疫间隔两周，加强免疫安排在第五次免疫后的4‑8周内，将两种免疫抗原各0.5mg混和后静脉注射，注射后4天杀兔子，取脾备用；4)无菌取脾脏，分离脾脏细胞，分离脾脏细胞的步骤为：在培养皿中去除脾脏周围的脂肪和其他组织；用1640培养液冲洗后，将脾脏置于不锈钢筛网上，挤压过筛；用1640培养液悬浮后离心，1400rpm，5min；弃上清，重复洗涤一次；用1640培养液重悬细胞，取少量细胞悬液稀释；用台盼蓝染色计算活细胞数；根据细胞计数，取含2×108个脾淋巴细胞的悬液备用；5)将脾脏细胞与240E细胞进行细胞融合，240E细胞是在细胞融合实验前一周传代培养的，融合当天收集生长旺盛、正处于对数生长期的240E细胞与免疫兔子的脾细胞融合，融合剂为50％的聚乙二醇，细胞融合前取240E细胞培养上清作为阴性上清对照；6)融合后的细胞用HAT作为选择性培养基，分装于加有饲养细胞的40块96孔细胞培养板中，置37℃、6％CO2培养箱内培养，2‑3周初检，取细胞培养孔上清，用间接ELISA法筛选出阳性克隆，将初检阳性的杂交瘤细胞转移至24孔细胞培养板中，一周后，采用间接ELISA法、间接竞争ELISA法筛选出分泌抗体亲和力强，细胞生长状态良好的杂交瘤细胞，将杂交瘤细胞在液氮中保存一份，一份用有限稀释法进行克隆化，每个多克隆分装于3块96孔细胞培养板中，三周后用间接ELISA法筛选出阳性克隆，每个多克隆选大于3个阳性孔，转移至24孔细胞培养板中，一周后，采用间接ELISA法、间接竞争ELISA法筛选出分泌抗体亲和力强，细胞生长状态良好的杂交瘤细胞，将该杂交瘤细胞在液氮中保存一份，一份用于扩大培养生产磺胺类兔单克隆抗体；