[发明专利]乙型肝炎病毒基因分型和定量检测的方法及试剂盒

摘要

本发明公开一种乙型肝炎病毒基因分型和定量检测的试剂盒，包括DNA提取试剂和荧光定量PCR试剂；荧光定量PCR试剂包括乙型肝炎病毒B基因型和C基因型的引物，还包括乙型肝炎病毒B基因型标准品和乙型肝炎病C基因型标准品。本发明还公开一种乙型肝炎病毒基因分型和定量检测的方法，其步骤如下：引物及探针的设计合成，临床血清样本的获得，提取乙型肝炎病毒DNA，进行荧光定量PCR反应，结果的判定。本发明分型准确率≥99%，比全序列分析比对的方法简单便捷，同时又比常规的PCR及酶切鉴定的方法更准确；可以在同一反应体系内同时检测中国人最常见的乙型肝炎病毒B基因型和C基因型，并且同时可以定量检测，更加节约成本和降低工作量，创新性明显。

主权项

乙型肝炎病毒基因分型和定量检测的试剂盒，其特征是：包括DNA提取试剂和荧光定量PCR试剂；其中的DNA提取试剂包括含6 mol/L异硫氰酸胍、30mol/L 柠檬酸钠、体积为0.58%的十二烷基磺酸钠、1 mol/L 乙二胺四乙酸钠、体积为2%的糖原的A液和B液－异丙醇；其中的荧光定量PCR试剂包括：含100 mmol/L pH8.9的Tris‑HCl、500 mmol/L KCl，体积为50%的甘油的10×PCR缓冲液；浓度为25mmol/L 的MgCl2；浓度为5mmol/L 的dNTP（三磷酸脱氧核糖核苷）；浓度为5U/μl 的Taq DNA聚合酶；浓度为1U/μl 为UDG酶（尿嘧啶‑N‑ 糖基化酶）；荧光定量PCR试剂还包括下述探针和相对应的引物：乙型肝炎病毒B基因型的引物序列为：HBV B F：AGACTCGTGGTGGACTTC      浓度为10μmol/LHBV B R：ACAAGAAGATGAGGCATAGC    浓度为10μmol/L乙型肝炎病毒B基因型的探针序列为：HBV B P：5’TCGCAGTCCCAAATCTCCA 3’    浓度为3μmol/L荧光探针的5’端标记的荧光报告基因是FAM，3’端标记的荧光受体基因为BHQ1的淬灭基团；乙型肝炎病毒C基因型的引物序列为：HBV C F：CTTGTTGGTTCTTCTGGACTAC     浓度为10μmol/L LHBV C R：AGGATGATGGGATGGGAATAC      浓度为10μmol/L乙型肝炎病毒C基因型的探针序列为：HBV C P：5’CCTCTACTTCCAGGAACATCAAC 3’   浓度为3μmol/L荧光探针的5’端标记的荧光报告基因是HEX，3’端标记的荧光受体基因为BHQ1的淬灭基团。