[发明专利]一种醋用复合酶制剂的制备方法

摘要

本发明公开了一种醋用复合酶制剂的制备方法，涉及生物工程微生物发酵领域，解决现有酿醋用的大曲活力不高，造成的原料利用率低，环境污染严重，醋的品质低的问题。一种醋用复合酶制剂的制备方法，包括以下步骤：菌种选育；斜面接种；摇瓶扩大培养；两级种子罐培养；2m3罐发酵培养；板框过滤；真空低温浓缩，然后将四种浓缩液体酶按照2∶2∶3∶3比例混合，即得到醋用复合酶制剂。本发明通过对关键微生物选育并扩大培养，采用液态发酵工艺，生产出适于酿醋用的复合酶系，以补充大曲中相应酶系的不足，强化关键酶系的活性，丰富与老陈醋品质有直接关系的酶系含量，通过与大曲联合应用于酿醋，设计最佳配比，达到提高醋品质及出品率的目的。

主权项

一种醋用复合酶制剂的制备方法，其特征是包括以下步骤：(1)菌种选育：将活化后的黑曲霉AS3.324接入固体斜面培养基中，30℃，培养36～40h后，用生理盐水将菌苔洗下，制备菌悬液，然后在紫外灯30W，距离30cm的条件下照射50～90s，之后按照1mg/mL的加入量加入亚硝基胍，处理30min，得到高产糖化酶菌株；以CICC编号2475黑曲霉为出发菌株，在紫外灯25～30W，距离30cm的条件下照射150～200s，得到高产纤维素酶菌株；以沪酿3042米曲霉为出发菌株，在紫外灯20w，距离28cm的条件下照射40～70s，然后接种到氯化锂培养基进行化学诱变72小时，得到高产蛋白酶菌株；以根霉Sp.Rhizopus 3.105(CICC编号40049)为出发菌株，在紫外灯30w，距离20cm的条件下照射40～70s，得到高产酯化酶菌株；(2)斜面接种：将上述高产糖化酶菌种接入固体斜面培养基中，30℃，培养36～40h，所述的固体斜面培养基为PDA培养基。将上述选育的高产纤维素酶黑曲霉菌株接种在斜面培养基上，其中斜面培养基是按照下列重量比的各组分为原料制备的：羧甲基纤维素钠(CMC)0.5％、硫酸铵0.2％、酵母膏0.1％、琼脂2％，调pH7.0～7.2；将上述选育的高产蛋白酶米曲霉菌株在豆汁斜面培养基中培养，豆汁培养基是按照下列重量比的各组分为原料制备的：豆汁(5°B’e)1000mL、可溶性淀粉20g、磷酸二氢钾1g、硫酸镁0.5g、硫酸铵0.5g，琼脂20g、调pH为6.5～7.0；将上述选育的高产酯化酶根霉菌株接种到斜面培养基中培养，在温度30～35℃的条件下培养间72h，斜面培养基是按照下列重量比的各组分为原料制备的：麸皮20g、蔗糖1.5g、琼脂1.5g、水100mL；(3)摇瓶扩大培养：将上述步骤斜面培养的黑曲霉接种于摇瓶培养基中，其中摇瓶转速为270r/min，32℃恒温摇床培养120h，其中摇瓶培养基是以下列重量份的各组分为原料制备的：玉米粉14％，豆饼粉4％，麸皮1％，余量为水；将上述步骤经斜面培养的黑曲霉接种于摇瓶培养基中，摇瓶转速为150r/m，31℃恒温培养96h，其中摇瓶培养基是按照下列重量比的各组分为原料制备的：稻草粉5％、麸皮1％、豆饼粉3％、玉米浆2％、磷酸二氢钾0.5％、氯化钙0.3％，调pH6.5～7.5；将经斜面培养的米曲霉接种于不添加琼脂的豆汁培养基中，转速为150～190r/m，31℃恒温培养96h；将经斜面培养的根霉接种于摇瓶培养基，摇瓶转速为150r/min，36℃恒温摇床培养36h，其中摇瓶培养基是按照下列重量比的各组分为原料制备的：麸皮6g、黄豆粉5g、磷酸氢二钾0.2g、水100mL、pH7.0；(4)两级种子罐培养：将上述四种经摇瓶扩大培养的菌株分别放入一级种子罐，接种量10％，在转速200～280r/min，温度32℃的条件下培养45‑50h；分别将上述四种经一级种子罐培养的菌种转入二级罐，在转速220r/min，电机功率11kW，温度34℃的条件下培养30～35h；上述的种子罐培养基分别是按照下列重量比的各组分为原料制备的：高产糖化酶黑曲霉菌株种子培养基：淀粉10％、豆饼粉4％、麸皮1％、磷酸氢二钾0.3％、氯化钙0.1％；高产纤维素酶菌株种子培养基：稻草粉5％、玉米粉1％、麸皮1％、硫酸铵0.3％、氯化钙0.1％、调pH7.0～7.2；高产蛋白酶菌株种子培养基：麸皮∶高粱粉∶水＝4∶1∶4；高产酯化酶菌株种子培养基：麸皮6％，豆粕水解液7％，磷酸氢二铵0.3％，氯化钙0.5％；(5)2m3罐发酵培养：将上述四种经二级发酵罐培养的菌种转入2m3发酵罐，在电机功率55kW，搅拌转速160‑200r/min，温度31℃的条件下发酵，待二次测定酶活力单位不再上升时即可终止发酵；(6)板框过滤：操作压力0.3‑0.6Mpa；(7)真空低温浓缩，然后将四种浓缩液体酶按照2∶2∶3∶3比例混合，即得得到醋用复合酶制剂。