[发明专利]奶牛金黄色葡萄球菌乳房炎灭活疫苗及其制备方法

摘要

本发明公开了一种奶牛金黄色葡萄球菌乳房炎灭活疫苗及其制备方法，主要包括5、8、336血清型不同菌株的金黄色葡萄球菌感染性奶牛乳房炎疫苗优势流行菌株，进一步通过发酵规模化生产菌液、灭活、纯化等工艺，经此形成灭活全菌、全菌+荚膜多糖、荚膜多糖结合蛋白抗原，不加或加入白花油、FIA、铝盐、MF59、SP01、SP02佐剂、免疫刺激复合物、免疫细胞因子等佐剂，制备单价、二价、三价、多价(如五价)奶牛5、8、336血清型不同菌株的金黄色葡萄球菌乳房炎灭活全菌疫苗、灭活全菌+荚膜多糖疫苗、荚膜多糖结合蛋白疫苗注射剂型，通过皮下注射、肌肉注射、乳头管注射、微针透皮免疫接种奶牛。

主权项

一种奶牛金黄色葡萄球菌乳房炎灭活疫苗及其制备方法，其特征是：(1)通过对奶牛乳腺炎奶汁样品进行分离、鉴定，确定奶牛金黄色葡萄球菌流行优势株为5、8、336血清型的不同菌株；制备5、8、336血清型优势流行菌株兔血清，与已有国内外临床分离奶牛金黄色葡萄球菌乳房炎菌代表株免疫交叉中和达96％以上，由此选用的奶牛乳房炎5、8、336型金黄色葡萄球菌优势疫苗株具有代表性的流行株；在本方法中，包括但不限于5、8、336血清型金葡菌作为奶牛乳腺炎疫苗候选优势菌株；包括任何适宜于制备奶牛乳房炎金葡菌疫苗生产的当前和今后广泛流行的金葡菌野生株；(2)选用奶牛金黄色葡萄球菌乳房炎5、8、336血清型优势疫苗株，通过BHI培养传代、建立奶牛金黄色葡萄球菌乳房炎灭活疫苗原始种子批、主种子批和工作种子批库，进一步通过理化性质、基因特征、毒理和免疫原性等全面分析，表明建立的奶牛5、8、336血清型金黄色葡萄球菌疫苗菌株三级种子批库符合疫苗生产用要求；在本方法中，包括但不限于5、8、336血清型金黄色葡萄球菌建立种子批库；包括适用于当前和今后广泛流行的金葡菌野生株或突变菌株所建立疫苗种子批库疫苗的生产；(3)通过奶牛乳房炎5、8、336血清型金黄色葡萄球菌苗工作种子批株，从10L到1000L发酵在BHI培养基中放大培养，制备奶牛5、8、336血清型金黄色葡萄球菌乳房炎菌苗原液，经甲醛灭活、离心分离、生化提取制备了纯化5、8、336等血清型灭活全菌、荚膜多糖抗原，抗原纯度达95％；通过对温度、时间、接种量等培养条件的优化，获得规模化生产灭活全菌、荚膜多糖疫苗抗原原液；进一步进行血清型别、理化性质、基因特征、外源因子、免疫原性等全面鉴定，由此可规模化用于疫苗的生产；在本方法中，包括但不限于5、8、336血清型金黄色葡萄球菌苗工作种子批株及BHI培养基用于疫苗原液规模化生产；包括用于当前和今后广泛流行的候选金葡菌优势疫苗株及LB等培养基介质；(4)纯化的奶牛5、8、336血清型金黄色葡萄球菌乳房炎灭活荚膜多糖疫苗原液，用偶联剂与破伤风毒素蛋白(TT)、白喉毒素蛋白(DT)、无毒力白喉毒素蛋白(CRM197)或其他合适的载体蛋白分子；依Pr‑L‑Ps结构式偶联，其中，Pr是载体蛋白，Ps是奶牛金葡菌荚膜多糖，L是共价键、或连接基团，且Ps∶Pr的质量比为0.5‑3.5∶1；先采用溴化氢活化多糖，然后再采用碳二亚胺将活化的多糖与蛋白共价偶联；制备出奶牛金葡菌乳房炎荚膜多糖结合蛋白抗原原液，交联率达85％以上，由此TT或DT或CRM197均可作为该疫苗载体结合蛋白；在本方法中，包括但不限于5、8、336血清型金黄色葡萄球菌灭活荚膜多糖和TT、DT、CRM197交联载体蛋白；包括适用于当前和今后广泛流行金葡菌株荚膜多糖及其它载体蛋白 分子；(5)制备的有效剂量纯化奶牛5、8、336型金黄色葡萄球菌乳房炎灭活全菌(比如1～10×1010CFU)、全菌(比如1～10×1010CFU)+荚膜多糖(比如10～60Ug)抗原、荚膜多糖结合蛋白抗原(比如40～60Ug/CPs‑10～20Ug/TT或DT或CRM197)分别与常规用量的白花油、FIA、铝盐、MF59、SP01和SP02等疫苗佐剂按比例混均匀，制备奶牛金葡菌乳房炎灭活全菌、全菌+荚膜多糖、荚膜多糖结合蛋白疫苗，分别免疫BALB/c鼠、家兔和奶牛动物，间隔28天，皮下免疫2次，间断采集奶汁、血清、血细胞及脾细胞，观察奶牛产奶量与质量、体温、体重、体细胞计数、排细菌计数及ELISA、ELISPOT测定抗体效价、细胞免疫水平及死亡情况。试验结果可见，这几种佐剂均能提高奶牛金葡菌乳房炎灭活疫苗抗体滴度、依次是FIA、白花油、SP01、MF59和铝盐佐剂，且在不同动物呈现一致性趋势；由此SP01、SP02、MF59、白花油、FIA和铝盐均可有效的作为奶牛乳房炎灭活疫苗的佐剂；在本方法中，包括但不限于SP01、SP02、MF59、白花油、FIA和铝盐佐剂中的一种或几种用于奶牛金葡菌灭活疫苗的制备；包括免疫刺激复合物、细胞因子、脂质体等佐剂用于制备奶牛金葡菌乳房炎灭活疫苗；(6)本发明的奶牛金葡菌乳房炎灭活疫苗可不含有佐剂，也可以含有SP01、SP02、MF59、白花油、FIA和铝盐佐剂中的一种或几种，按有效剂量制备有或无佐剂的奶牛金葡菌灭活单价、二价、三价、多价(5、8、336等血清型的不同菌株)灭活菌体(1～10×1010CFU)疫苗注射剂型；制备有或无佐剂的奶牛金葡菌单价、多价(5、8、336等血清型)灭活全菌(1～10×1010CFU)+荚膜多糖(10～60Ug)疫苗注射剂型；制备有或无佐剂的奶牛金葡菌单价、二价、三价、多价(如五价)灭活荚膜多糖结合蛋白(40～60Ug/CPs‑10～20Ug/TT或DT或CRM197)疫苗注射剂型；在本发明专利中，包括但不限于制备5、8、336血清型金黄色葡萄球菌乳房炎灭活疫苗；包括适用于当前和今后广泛流行奶牛乳房炎新的金葡菌野生株或突变株灭活疫苗注射剂型的制备。