[发明专利]高效表达类胰岛素生长因子IGF-1的乳腺特异性表达载体

摘要

本发明公开了高效表达类胰岛素生长因子IGF-1的乳腺特异性表达载体，属于生物工程技术领域。IGF-1的cDNA序列见SEQ ID NO.1。将本发明构建的乳腺特异性表达载体pIN在体外采用脂质体法转染到人乳腺癌细胞Bcap-37，转染后提取细胞上清蛋白和细胞蛋白；采用western blot和放免方法检测细胞上清蛋白和细胞蛋白中IGF-1含量。结果显示与未转染乳腺特异性表达载体pIN的对照组相比，转染乳腺特异性表达载体pIN组中，IGF-1表达量显著提高。表明pIN载体可已在乳腺细胞上成功表达IGF-1，为下一步生产转IGF-1基因奶山羊奠定坚实的基础。

主权项

一种高效表达类胰岛素生长因子IGF‑1的乳腺特异性表达载体，其igf‑1基因具有如SEQ ID NO.1所示的序列，其构建方法包括：1)萨能奶山羊类胰岛素生长因子基因igf‑1的克隆参照NCBI上genebank登录号：D11378的山羊IGF‑1mRNA全序列引物设计如下：上游引物：5’‑ACAGGTACCATGGGAAAAATCAGCAGTCT‑3’下游引物：5’‑CGCAAGCTTCTACATTCTGTAGTTCTTGT‑3’以萨能奶山羊肝脏组织提取的总RNA为模板，经M‑MLV反转录酶合成cDNA第一链后进行PCR扩增；反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性30s，57℃复性30s，72℃延伸45s，30个循环后；72℃延伸10min；将PCR克隆至pMD19‑T载体，测序后获得具有完整编码区的萨能奶山羊类胰岛素生长因子基因igf‑1的cDNA序列SEQID NO.1；2)乳腺特异性表达载体的构建根据骨架载体pBC1和SEQ ID NO.1序列，设计特异性引物：上游引物：5’‑ATCGCGGATCCTCGAGATGGGAAAAATCAG‑3’下游引物：5’‑GGTCCGGATCCTCGAGGAGCTCCTACATTCTGTAG‑3’以步骤1)中获得的PCR扩增产物为模板，经PCR扩增将获得的igf‑1序列克隆至pBC1载体上，获得载体pI；进一步将筛选标记基因neo克隆到载体pI上获得乳腺特异性表达载体pIN。