[发明专利]表达高致病性禽流感病毒H5亚型血凝素蛋白的重组嗜酸乳杆菌

摘要

本发明涉及表达高致病性禽流感病毒H5亚型血凝素蛋白的重组嗜酸乳杆菌，属于生物技术基因工程领域。本发明成功构建了高致病性禽流感病毒H5亚型血凝素重组乳酸杆菌表达质粒pLEM415-PHA1，并成功电击转化入嗜酸乳杆菌4356。高致病性禽流感病毒H5亚型血凝素蛋白在重组嗜酸乳杆菌4356内可以被成功表达，经Western-blot验证具有良好的抗原性。重组嗜酸乳杆菌4356有望开发成预防高致病性禽流感的基因工程口服疫苗。

主权项

高致病性禽流感病毒H5亚型血凝素蛋白的重组表达质粒，是由以下方法构建而成：(1)高致病性禽流感病毒H5亚型血凝素HA1，其序列为SEQ ID NO.1；乳酸脱氢酶LDH的启动子基因P，其序列为SEQ ID NO.4，其克隆过程如下：设计启动子引物P1、P2：P1 5’‑TAAGGTACCTACTGAGAAGTTGCTC‑3’P2 5’‑TAACTCGAGGCCGACGAGGATAACT‑3’5’端分别引入KpnI和XhoI限制性内切酶酶切位点，TAA为保护碱基，以质粒pRV85为模板，常规PCR克隆乳酸脱氢酶启动子P；设计高致病性禽流感病毒血凝素HA1引物HAF1、HAR2：HAF1 5’‑TAACTCGAGAAAATGGAGAAAATAGTGCTTC‑3’HAR2 5’‑TAAGATATCCTACAATCTGAACTCACAAATT‑3’5’端分别引入XhoI和EcoRV限制性内切酶酶切位点，TAA为保护碱基，以质粒pCI‑H5HA为模板，常规PCR克隆高致病性禽流感血凝素基因HA1；(2)重组表达质粒pLEM415‑PHA1的构建利用酶切连接技术，分别将乳酸脱氢酶启动子P和高致病性禽流感血凝素HA1目的片段连接在大肠‑乳酸杆菌穿梭质粒pLEM415上，得到重组表达质粒pLEM415‑PHA1；采用限制性内切酶KpnI、XhoI、EcoRV，分别用双酶切验证。