[发明专利]一种同时标记肿瘤IV型胶原、巨噬细胞和新生血管的方法

摘要

本发明公开了一种同时标记肿瘤IV型胶原、巨噬细胞和新生血管的方法，其步骤：1、组织切片，固定于经多聚赖氨酸处理的防脱载玻片上；2、将组织切片放入二甲苯中脱蜡；3、抗原修复；4、洗涤切片；5、封闭；6、加一抗；7、洗涤切片；8封闭，同步骤4；9、用二抗为量子点QDs525标记的山羊抗鼠免疫球蛋白G的抗原结合片段F(ab′)2-QDs525、量子点QDs585标记的山羊抗兔免疫球蛋白G的抗原结合片段F(ab′)2-QDs585、量子点QDs655标记的兔抗山羊免疫球蛋白G的抗原结合片段F(ab′)2-QDs655，去除封闭液后，滴加混合物；10、洗涤切片；11、封片，用甘油和TBS10ml配成缓冲甘油，缓冲甘油封片后保存。本发明用于肿瘤组织微环境多种成分的高效、准确、快速、同时检测。

主权项

一种同时标记肿瘤IV型胶原、巨噬细胞和新生血管的方法，其步骤是：A、福尔马林固定石蜡包埋的肿瘤组织4μm厚切片，固定于经多聚赖氨酸处理的防脱载玻片上；B、组织切片的准备， 将组织切片放入二甲苯中脱蜡三次，每次4‑6分钟，脱蜡后将组织切片依次放入无水乙醇4‑6分钟、95%体积比酒精1‑3分钟、95%体积比酒精1‑3分钟和80%体积比酒精1‑3分钟，流水冲洗3~5分钟；C、抗原修复，用柠檬酸三钠29.41g，双蒸水1000ml配制柠檬酸三钠缓冲液，柠檬酸10.5g，双蒸水500 ml配制柠檬酸缓冲液，分别取柠檬酸三钠缓冲液20.25ml、柠檬酸缓冲液4.75ml和225ml双蒸水配制成柠檬酸抗原修复液：0.01mol，pH 6.0，250ml，将组织切片置于加入了250ml抗原修复液的抗原修复盒中微波修复，低火修复4‑6分钟后转至中火修复9‑11分钟，然后室温放置待玻片自然冷却；D、自来水冲洗后取出切片，洗涤切片，用三羟基氨基甲烷6.05g和氯化钠38.0g及双蒸水5000ml，配制0.01M/L、pH7.2‑7.4的三羟甲基氨基甲烷缓冲盐水作为洗涤液，洗涤3次，每次3分钟；E、封闭，封闭液位含有2%wt/vol牛血清白蛋白的TBS，封闭条件为：湿盒孵育，37℃, 30min；F、加一抗，去除上述封闭液后，滴加鼠抗人巨噬细胞单克隆抗体、兔抗人IV型胶原多克隆抗体、山羊抗人CD105多克隆抗体的一抗混合物，37℃湿盒内孵育3~4h或4℃冰箱过夜； G、洗涤切片，清洗液为含0.5%/vol/vol吐温#20的TBS，洗涤3次，每次3min；H、封闭，同步骤（D）；I、用二抗为量子点QDs525标记的山羊抗鼠免疫球蛋白G的抗原结合片段量子点QDs525、量子点QDs585标记的山羊抗兔免疫球蛋白G的抗原结合片段量子点QDs585、量子点QDs655标记的兔抗山羊免疫球蛋白G的抗原结合片段F(ab′ )2‑QDs655，去除上述封闭液后，滴加量子点QDs525、量子点QDs585和量子点QDs655混合物，稀释液为含2%wt/vol牛血清白蛋白的TBS，湿盒孵育，37℃，2~3h； J、洗涤切片，清洗液与步骤（G）所用清洗液相同，TBS按步骤（D）的配方制备，洗涤2次，每次2min，再用TBS洗涤一次，3min；K、封片，用甘油90ml和TBS10ml配成90%体积比缓冲甘油，缓冲甘油封片后4℃保存，在荧光显微镜下用紫外光330~385nm激发观察到显示绿色荧光的巨噬细胞、显示橙黄色荧光的IV型胶原和显示红色荧光的肿瘤新生血管。