[发明专利]奶牛链球菌乳房炎灭活疫苗及其制备方法

摘要

本发明公开了一种奶牛链球菌乳房炎灭活疫苗及其制备方法，主要包括无乳、停乳、乳房型链球菌感染性奶牛乳房炎疫苗优势流行菌株，进一步通过发酵规模化生产菌液、灭活、纯化等工艺，经此形成灭活全菌、全菌+荚膜多糖、荚膜多糖结合蛋白抗原，不加或加入白花油、FIA、铝盐、MF59、SP01、SP02佐剂、免疫刺激复合物、免疫细胞因子等佐剂，制备单价、二价、三价或多加奶牛无乳、停乳、乳房型链球菌乳房炎灭活全菌疫苗、灭活全菌+荚膜多糖疫苗、荚膜多糖结合蛋白疫苗注射剂型，通过皮下注射、肌肉注射、乳头管注射、微针透皮免疫接种奶牛后，可安全、稳定、全面有效预防链球菌感染所致奶牛乳房炎的发生。

主权项

一种奶牛链球菌乳房炎灭活疫苗及其制备方法，其特征是：(1)通过对奶牛乳腺炎奶汁样品的分离、鉴定，确定奶牛链球菌流行优势株为无乳、停乳、乳房血清型，制备优势流行菌株兔血清与已有国内外代表奶牛链球菌乳房炎菌株免疫交叉中和活性达95％以上，由此选用的无乳、停乳、乳房等血清型链球菌优势疫苗株具有代表国内外奶牛乳房炎流行菌株；在方法中，包括但不限于无乳、停乳、乳房血清型链球菌作为奶牛乳腺炎疫苗候选优势菌株；包括适宜于制备奶牛乳房炎链球菌疫苗生产的当前和今后广泛流行野生株或突变株；(2)选用奶牛链球菌乳房炎无乳、停乳、乳房血清型优势疫苗株，通过培养传代、建立了奶牛链球菌乳房炎灭活疫苗原始种子批、主种子批和工作种子批库，进一步通过理化性质、基因特征、毒理和免疫原性等全面分析，表明建立的奶牛无乳、停乳、乳房等血清型链球菌疫苗菌株三级种子批库符合疫苗生产要求；在本方法中，包括但不限于无乳、停乳、乳房血清型链球菌建立种子批库；包括适用于当前和今后广泛流行的链球菌野生株或突变株，均可建立疫苗株种子批库用于疫苗生产；(3)通过奶牛乳房炎菌无乳、停乳、乳房血清型链球菌菌苗工作种子批株，从10L到1000L发酵放大培养，制备了无乳、停乳、乳房等血清型奶牛链球菌乳房炎菌苗原液，经甲醛灭活、离心分离、生化常规方法提取制备了纯化无乳、停乳、乳房血清型灭活全菌、荚膜多糖抗原，抗原纯度达95％；通过对温度、时间、接种量等培养条件的优化，获得了规模化生产灭活全菌、荚膜多糖疫苗原液；进一步血清型别、理化性质、基因特征、外源因子、免疫原性等全面鉴定，由此规模化制备的疫苗抗原可以产业化生产。在本方法中，包括但不限于无乳、停乳、乳房血清型金黄色葡萄球菌苗工作种子批株、BHI培养基用于疫苗原液规模化生产；也包括适用于当前和今后广泛流行的候选链球菌新优势菌株及THB等培养基介质；(4)纯化的无乳、停乳、乳房等血清型链球菌乳房炎灭活荚膜多糖疫苗原液，用偶联剂与破伤风毒素蛋白(TT)、白喉毒素蛋白(DT)、无毒力白喉毒素蛋白(CRM197)或其他合适的载体蛋白分子；依Pr‑L‑Ps结构式偶联，其中，Pr是载体蛋白，Ps是奶牛链球菌荚膜多糖， L是共价键、或连接基团，且Ps∶Pr的质量比为0.5‑3.5∶1；先采用溴化氢活化多糖，然后再采用碳二亚胺将活化的多糖与蛋白共价偶联；制备出奶牛链球菌奶牛乳房炎荚膜多糖结合蛋白抗原原液，TT或DT或CRM197载体蛋白与各血清型荚膜多糖结合蛋白都有好的交联效果，交联率达85％以上，由此TT或DT或CRM197均可作为该疫苗载体结合蛋白；在本方法中，包括但不限于无乳、停乳、乳房血清型链球菌灭活荚膜多糖和TT、DT、CRM197交联载体蛋白；包括适用于当前和今后广泛流行链球菌野生株株、突变株荚膜多糖及其他载体蛋白；(5)制备的有效剂量纯化奶牛乳房炎无乳、停乳、乳房血清型链球菌灭活全菌(比如1～10×1010CFU)、全菌(比如1～10×1010CFU)+荚膜多糖(比如10～60Ug)抗原、荚膜多糖结合蛋白抗原(比如40～60Ug/CPs‑10～20Ug/TT或DT或CRM197)分别与常规用量的白花油、FIA、铝盐、MF59、SP01和SP02疫苗佐剂混均匀，制备奶牛链球菌乳房炎灭活全菌、全菌+荚膜多糖、荚膜多糖结合蛋白疫苗，分别免疫BALB/c、豚鼠、家兔和奶牛动物，间隔28天，皮下或肌肉或乳头管免疫2次，末次免疫14天采集血清、奶汁、脾淋巴细胞，观察奶牛产奶量与质量、体温、体重、体细胞计数、排细菌计数及ELISA、ELISPOT测定抗体效价、细胞免疫水平及死亡情况；试验结果可见，这几种佐剂可提升奶牛链球菌乳房炎灭活疫苗产生高效价抗体滴度、依次是白花油、不完全弗氏、SP01、MF59和铝盐佐剂，而SP01、SP02还产生了细胞免疫和黏膜免疫效应，且在不同动物呈现一致性趋势；由此SP01、SP01、MF59、白花油、不完全弗氏和铝盐均可有效的作为奶牛乳房炎灭活疫苗的佐剂；在本方法中，包括但不限于SP01、SP02、MF59、白花油、FIA和铝盐佐剂中的一种或几种用于奶牛链球菌灭活疫苗的制备；包括适用于免疫刺激复合物、细胞因子、脂质体等佐剂制备奶牛链球菌乳房炎灭活疫苗；(6)本发明的奶牛链球菌乳房炎灭活疫苗可不含有佐剂，也可以含有SP01、SP02、MF59、白花油、FIA和铝盐佐剂中的一种或几种，以有效剂量制备有或无佐剂的奶牛链球菌灭活单价、多价(无乳、停乳、乳房血清型)菌体(比如1～10×1010CFU)疫苗注射剂型；制备有或无佐剂的奶牛链球菌灭活单价、二价、三价、多价(无乳、停乳、乳房等血清型)菌体(比 如1～10×1010CFU)+荚膜多糖(比如10～60Ug)疫苗注射剂型；制备有或无佐剂的奶牛链球菌灭活单价、多价荚膜多糖结合蛋白(比如40～60Ug/CPs‑10～20Ug/TT或DT或CRM197)疫苗注射剂型。