[发明专利]脂联素基因表达水平在肉牛肌肉大理石纹等级鉴定中的应用

摘要

本发明涉及一种脂联素基因表达水平在肉牛肌肉大理石纹等级鉴定中的应用，其特征在于：采用克隆脂联素基因cDNA全序列，建立脂联素mRNA的实时荧光定量检测方法；并确定脂联素基因表达水平在肉牛肌肉大理石纹等级鉴定中的应用。其采用荧光定量RT-PCR检测ADPNmRNA方法具有很好的灵敏性和重复性。检测结果用拷贝数来表示起始模板的含量,相对半定量RT-PCR中的比较值更为准确可靠，ADPNmRNA水平与育肥牛的肌肉大理石纹呈负相关（延边黄牛r=-0.87;P﹤0.001，n=9）和（草原红牛r=-0.79;P﹤0.001，n=9）。准确率达95%。

主权项

1.一种脂联素mRNA的实时荧光定量检测方法，其特征在于：采用克隆脂联素基因cDNA全序列，建立脂联素mRNA的实时荧光定量检测方法；具体步骤如下：（1）应用生物信息学知识, 从Genebank 中查阅出ADPN 的DNA和 mRNA 序列,根据引物设计原则,并利用Primer Express 2. 0 设计软件,设计出扩增ADPN mRNA 基因片段的引物和探针,序列如下；　表1　 ADPN引物和探针（2）常规RT-PCR 扩增ADPN mRNA  用Trizol ( Invitrogen公司) 提取奶牛皮下脂肪组织的总RNA ,进行逆转录PCR；将纯化的PCR 产物连接至pMD18-T 载体上,转化至感受态JM109大肠杆菌,挑取重组成功的菌落进行培养,并用小批量质粒DNA 纯化系统试剂盒(TaKaRa公司) 提取质粒；（3）取1μg 重组质粒,用PCR鉴定,同时对重组的质粒进行测序分析(上海生工) ；用DNASIS软件将测序结果与GenBank上的序列进行同源性比较；（4）用DNAquent测量提取的质粒的浓度,将质量单位转换为分子数,用灭菌纯水将以上重组质粒按梯度稀释为1 ×10⁹、1 ×10⁸、1 ×10⁷ 、1 ×10⁶ 、1 ×10⁵ 、1 ×10⁴ 、1 ×10³ 、1 ×10² 、1 ×10¹ 、1 ×10⁰ 拷贝数/μl ；这些不同浓度梯度的重组质粒作为荧光定量PCR 反应的阳性标准模板；PCR体系为（25μL）：ddH₂O 13.5μL；10×Taq-buffer 2.5μL；dNTPs Mixture（各2.5mM） 4.0μL；上游引物（15pM）、下游引物（15pM）、探针（12pM）各1.0μL；Ex Taq酶（1U/μL）1.0μL；temperate DNA 1.0μL；（5）先95℃预变性3 min，然后按95℃变性15 sec，60℃退火1 min，共计50个循环；（6）反应在ABI PRISM 7000型荧光定量PCR扩增仪（美国ABI公司）上进行；所有反应信息资料被ABI PRISM 7000型荧光定量PCR扩增仪收集并储存于其附件电脑(含相应的分析软件) 中,反应结束后该电脑根据阳性定量标准模板的扩增情况自动绘制标准曲线。