[发明专利]一种铁皮石斛组培菌根化种苗生产方法

摘要

一种铁皮石斛组培菌根化种苗生产方法，其步骤分为：(1)采用固体或液体培养基对菌根真菌进行培养，菌根真菌采用菌根真菌LP1为毛壳菌属(Chaetomiumsp.)；(2)菌根细菌的培养，菌根细菌DP6为固氮菌(Azotobactersp.)；(3)铁皮石斛组培苗培养；(4)组培苗的水培炼苗。采用本发明提供的铁皮石斛组培菌根化苗的生产方法，不仅促进铁皮石斛组培种苗生长，而且组培苗明显粗壮。移栽后，成活率可达95%以上，生长量大，新芽分蘖多且长势迅猛，抗逆性强。与不接菌根真菌和细菌组培的铁皮石斛苗对照组相比，接菌的铁皮石斛苗比对照植株根系发达，植株节间明显膨大，鲜重提高10~20%。

主权项

一种铁皮石斛组培菌根化种苗生产方法，其特征在于步骤如下：(1)菌根真菌的培养将菌根真菌LP1菌株自低温保藏的斜面试管菌种活化后，接于PDA平皿中，于23~28℃恒温培养10~15 d，在菌落边缘打孔成菌片，并以小块接入固体培养基或液体培养基；菌根真菌LP1为毛壳菌属(Chaetomium sp.)，该菌种保藏于中国药用微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CPCC 480286；菌根真菌的固体培养基含有木质素、纤维素、碳、氮等营养素，由选自原料棉籽壳、木屑、碎玉米芯、阔叶树锯末、麦麸中的一种或几种组成，加水，水量为原料的150~200 wt%；高压灭菌后分别接入经培养所得菌根真菌LP1，每100 g培养基接2~3片菌片；真菌用试管、锥形瓶或培养瓶等器皿静置暗培养，待菌丝大部分或全部长满培养基时取出备用；菌根真菌的液体培养基含有葡萄糖、无机盐类成分和天然添加物；菌根真菌的液体培养基用水配制，其中葡萄糖18~22 g/L(优选20 g/L)，KH2PO4 18~22 g/L(优选20 g/L)，MgSO4 1.2~1.8 g/L(优选1.5 g/L)，维生素B1 8~12 mg/L(优选10 mg/L)，天然物：麦麸25~35 g/L (优选30 g/L)(煮汁)或马铃薯180~220 g/L(优选200 g/L)(使用其浸出液)，培养基pH 值为5.6~6.5(优选pH=6.0)；高压灭菌后接入经培养所得菌根真菌LP1，每100 mL培养基接入1~2片菌片；真菌用三角瓶或其他容器通气暗培养，盛装量为50%，置于23~25℃振荡，转速100~120 rpm，培养20~30 d后收获；培养结束后得到液态菌根真菌，可直接使用或用匀浆机打碎培养产物备用；(2)菌根细菌的培养配制无氮培养基：葡萄糖8~12g/L，NaCl 0.18~0.22 g/L，KH2PO4 0.18~0.22 g/L，CaSO4·2H2O 0.08~0.12g/L，MgSO4 0.18~0.22g/L，CaCO3 4~6 g/L，其余为水；调节pH值为6.9~7.2，于120℃高压灭菌20 min后，放入4℃冰箱备用，保存不超过半年；将菌根细菌DP6自低温保藏的斜面试管菌种活化后，接于上述配制的无氮培养基中，20～30℃水浴静止培养16 h，或者20～30℃水浴摇床，转速100~120 rpm培养8~10 h；菌根细菌DP6为固氮菌(Azotobacter sp.)，保藏于中国林业微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CFCC1605； (3)铁皮石斛组培苗培养本步骤在培养室中培养，温度为23~27℃，采用组培特定光谱节能灯(红光：波长640~650 nm，蓝光：波长450~460 nm)作为光源，每天光照10~14 h(优选12 h)；取野生的生长一年的铁皮石斛的茎进行灭菌处理，将灭菌的石斛茎切成带有茎节的段，接种于诱导培养基 (1/2‑1)N6+BA 2.5 mg/L，诱导茎节发芽；将芽接种于培养基(1/2‑1)N6+BA 2.5 mg/L+IBA 0.5 mg/L，诱导出大量原球茎；将原球茎接种于培养基(1/2‑1)N6+BA 1.5 mg/L+NAA 1.2 mg/L+5 wt%香蕉汁，诱导原球茎分化成小芽；将小芽接种于培养基(1/2‑1)N6+BA 1.0 mg/L+NAA 1.5 mg/L+7.5 wt%香蕉汁中，在此培养基中同时加入备好的液体菌根真菌1.5~3.0 mL/L或固体菌根真菌1.5~3.0 g/L，以及细菌培养液1~2 mL/L，在此培养基中小芽生长成小植株；再加入培养液BA 0.75 mg/L+NAA 2.0 mg/L+10 wt%香蕉汁+蔗糖3 wt%+液体菌根真菌1.5~3.0 mL/L或固体菌根真菌1.5~3.0 g/L+细菌培养液1~2 mL/L，其pH=5.8，待小芽生长成中植株；最后加入培养液BA 0.5 mg/L+NAA 2.5 mg/L+12.5% wt香蕉汁+3 wt%蔗糖+液体菌根真菌1.5~3.0 mL/L或固体菌根真菌1.5~3.0 g/L+细菌培养液1~2 mL/L，其pH=5.8，待中植株生长成大植株；(4)组培苗的水培炼苗营养液由以下组分构成：硝酸钾1.0～1.2 wt‰(优选1.1 wt‰)，硫酸铵0.18～0.22 wt‰(优选0.2 wt‰)，硝酸铵0.08～0.12 wt‰(优选0.1 wt‰)，硫酸镁0.1～0.14 wt‰(优选0.12 wt‰)，磷酸二氢钾0.08～0.12 wt‰(优选0.10 wt‰)，氯化钙0.04～0.08 wt‰(优选0.06 wt‰)，硫酸锰0.01～0.03 wt‰(优选0.02 wt‰)，硫酸亚铁0.02～0.04 wt‰(优选0.03 wt‰)，硫酸锌0.004～0.006 wt‰(优选0.005 wt‰)，其余为水；将得到的铁皮石斛培养苗取出，用15~20℃(优选17℃)的清水冲洗，沥去多余水分，栽种于架在营养液槽上的打好小孔的泡沫板的孔隙中，将营养液注入营养液槽中，使营养液浸没根系的40~60%，开动营养液槽的循环水泵，流速4~6 m/s；通风，风速0.3~0.5 m/s，进行种苗炼化；18~22 d后，铁皮石斛种苗根系发达，再生根增多，茎长长增粗，叶片变绿，变厚，即可以拔出进行大田移栽。