[发明专利]临床治疗用脐带间充质干细胞的制备和保存无效
申请号: | 201010585066.3 | 申请日: | 2010-12-13 |
公开(公告)号: | CN102154200A | 公开(公告)日: | 2011-08-17 |
发明(设计)人: | 王福生;施明;徐若男 | 申请(专利权)人: | 中国人民解放军第三○二医院 |
主分类号: | C12N5/0775 | 分类号: | C12N5/0775 |
代理公司: | 北京华科联合专利事务所 11130 | 代理人: | 王为 |
地址: | 100039*** | 国省代码: | 北京;11 |
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摘要: | 本发明涉及一种临床治疗用脐带间充质干细胞的制备和保存,其制备方法如下:用含0.2%庆大霉素、0.54%抗凝剂的生理盐水保存脐带,将脐带剪切至2-3cm,离心,悬浮,离心,直接贴壁植块培养,加入含15%胎牛血清、0.2%庆大霉素的α-MEM培养基培养,细胞融合后用含0.05%胰酶/0.2mMEDTA的消化液消化,按1∶3传代,传至4~5代,可获得大量间充质干细胞,加入冻存液(培养基∶胎牛血清∶DMSO=5∶4∶1)后,-70℃冰箱放置隔夜后置于液氮中保存,液氮冷冻温度为-196℃。 | ||
搜索关键词: | 临床 治疗 脐带 间充质 干细胞 制备 保存 | ||
【主权项】:
一种以脐带为来源的间充质干细胞的制备方法,其特征在于,经过以下步骤:1).无菌条件下采集正常顺产或剖腹产者胎儿脐带,用含0.2%庆大霉素、0.54%枸橼酸钠抗凝剂的生理盐水保存脐带组织,2).将脐带置于含0.2%庆大霉素的生理盐水中,反复冲洗2‑3次,用无菌剪刀剪断脐静、动脉血管,剔除肉眼可见的血管组织和可能存在的血凝块,用剪刀将脐带剪切至2‑3cm大小,收集组织块置于50ml离心管内,高速离心,离心机转速为2000转/分钟,离心10分钟,弃掉上清,重新加入含0.2%庆大霉素的生理盐水,将沉淀的组织块充分振荡,使之松散,高速离心,离心机转速为2000转/分钟,离心10分钟,3).将步骤2所获的组织块用含15%胎牛血清、0.2%庆大霉素的α‑MEM培养基悬浮,充分振荡后高速离心,离心机转速为2000转/分钟,离心10分钟,4).将步骤3所获的脐带组织块平铺于塑料培养瓶内,各组织块间存留1‑2cm空隙,置于37℃5%CO2培养箱内60分钟,待组织块完全贴壁后,补加含15%胎牛血清、0.2%庆大霉素的α‑MEM培养基,5).每培养3‑5天进行半量换液处理,6).于培养第10‑12天左右在倒置显微镜下观察到组织块周围出现贴壁、梭型或多角型细胞时,将组织块全部吸出,补加含15%胎牛血清、0.2%庆大霉素的α‑MEM培养基,置于5%CO2培养箱中继续培养,成为形态较为均一的长梭型细胞,呈涡旋状生长,7).待涡旋状生长的细胞80%融合后,先用生理盐水反复冲洗培养瓶3次,用含0.05%胰酶/0.2mM EDTA的消化液消化细胞,按1∶3传代,培养条件更换为含10%胎牛血清、0.2%庆大霉素的α‑MEM培养基,8).经20‑25天扩增后,细胞传至4~5代,可获得大量间充质干细胞,9).将扩增后细胞加入培养基∶胎牛血清∶DMSO=5∶4∶1的冻存液,放入细胞冻存盒内,‑70℃冰箱放置隔夜后置于液氮中保存,置于液氮中保存即可。
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