[发明专利]临床治疗用脐带间充质干细胞的制备和保存

摘要

本发明涉及一种临床治疗用脐带间充质干细胞的制备和保存，其制备方法如下：用含0.2％庆大霉素、0.54％抗凝剂的生理盐水保存脐带，将脐带剪切至2-3cm，离心，悬浮，离心，直接贴壁植块培养，加入含15％胎牛血清、0.2％庆大霉素的α-MEM培养基培养，细胞融合后用含0.05％胰酶/0.2mMEDTA的消化液消化，按1∶3传代，传至4～5代，可获得大量间充质干细胞，加入冻存液(培养基∶胎牛血清∶DMSO＝5∶4∶1)后，-70℃冰箱放置隔夜后置于液氮中保存，液氮冷冻温度为-196℃。

主权项

一种以脐带为来源的间充质干细胞的制备方法，其特征在于，经过以下步骤：1).无菌条件下采集正常顺产或剖腹产者胎儿脐带，用含0.2％庆大霉素、0.54％枸橼酸钠抗凝剂的生理盐水保存脐带组织，2).将脐带置于含0.2％庆大霉素的生理盐水中，反复冲洗2‑3次，用无菌剪刀剪断脐静、动脉血管，剔除肉眼可见的血管组织和可能存在的血凝块，用剪刀将脐带剪切至2‑3cm大小，收集组织块置于50ml离心管内，高速离心，离心机转速为2000转/分钟，离心10分钟，弃掉上清，重新加入含0.2％庆大霉素的生理盐水，将沉淀的组织块充分振荡，使之松散，高速离心，离心机转速为2000转/分钟，离心10分钟，3).将步骤2所获的组织块用含15％胎牛血清、0.2％庆大霉素的α‑MEM培养基悬浮，充分振荡后高速离心，离心机转速为2000转/分钟，离心10分钟，4).将步骤3所获的脐带组织块平铺于塑料培养瓶内，各组织块间存留1‑2cm空隙，置于37℃5％CO2培养箱内60分钟，待组织块完全贴壁后，补加含15％胎牛血清、0.2％庆大霉素的α‑MEM培养基，5).每培养3‑5天进行半量换液处理，6).于培养第10‑12天左右在倒置显微镜下观察到组织块周围出现贴壁、梭型或多角型细胞时，将组织块全部吸出，补加含15％胎牛血清、0.2％庆大霉素的α‑MEM培养基，置于5％CO2培养箱中继续培养，成为形态较为均一的长梭型细胞，呈涡旋状生长，7).待涡旋状生长的细胞80％融合后，先用生理盐水反复冲洗培养瓶3次，用含0.05％胰酶/0.2mM EDTA的消化液消化细胞，按1∶3传代，培养条件更换为含10％胎牛血清、0.2％庆大霉素的α‑MEM培养基，8).经20‑25天扩增后，细胞传至4～5代，可获得大量间充质干细胞，9).将扩增后细胞加入培养基∶胎牛血清∶DMSO＝5∶4∶1的冻存液，放入细胞冻存盒内，‑70℃冰箱放置隔夜后置于液氮中保存，置于液氮中保存即可。