[发明专利]一种驽巴贝斯虫病免疫印迹检测方法及试剂盒制备

摘要

本发明公开了一种驽巴贝斯虫病免疫印迹检测方法及试剂盒，本发明驽巴贝斯虫病免疫印迹检测方法，是以辣根过氧化物酶标记的羊抗马二抗结合物、化学发光底物在获得诊断抗原和阳性对照血清的基础上建立的；本发明方法试剂用量少成本低、特异性高、灵敏度高操作更快捷且无毒无害，所需条件低、试验结果易判定和长期保存，特异性比ELISA更强，用本发明检测均未发现假阳性和假阴性的结果。

主权项

一种驽巴贝斯虫病免疫印迹诊断试剂盒，其特征在于包括：（1）驽巴贝斯虫病免疫印迹诊断抗原（2）辣根过氧化物酶（HRP）标记的羊抗马结合物（3）阳性对照血清、阴性对照血清（4）底物（5）蛋白分子量标准标记物（6）4 ‑12 % Bis‑Tris胶（7）硝酸纤维膜（8）MOPS  SDS Running Buffer（9）NuPAGE Antioxidant（10）转印缓冲液（11）磷酸盐缓冲液（12）封闭液（13）洗液(14)感光胶片(15)使用说明书所述底物是peroxide solution+Luminol enhancer solution）根据权利要求1所述一种驽巴贝斯虫病免疫印迹诊断试剂盒，其特征在于试剂盒中的驽巴贝斯虫病免疫印迹诊断抗原通过下述方法制备：（1）制备虫体培养用红细胞：无菌采集健康马血，离心处理后用VYM’s缓冲液洗涤、悬浮得到；离心条件：4℃‑8℃，低速， 30±5 min；（2）建立及扩大驽巴贝斯虫体外培养无菌采集感染驽巴贝斯虫病马的抗凝血，经离心处理，用3x VYM’s缓冲液洗涤、悬浮获得染虫红细胞后，采用HL‑1组织培养液培养，当染虫率达到1.5%‑2%时即进行分代培养；之后每当染虫率达到2%或以上时即扩大培养；培养环境为：93%N2，2.0%O2，5%CO2；一个培养周期为24 小时； （3）制备驽巴贝斯虫病免疫印迹杂交诊断抗原当步骤（2）培养物的染虫率超过3%时，收集培养物，经离心、洗涤，最后以PI buffer+1%NP40溶解至清亮，再加入 LDSsample buffer（4x） 、ample Reducing Agent（10x），充分混匀；煮沸，迅速冷却，即得驽巴贝斯虫病免疫印迹诊断抗原。