[发明专利]降解赤霉病菌毒素基因产物检测

摘要

本发明公开了一种降解赤霉病菌毒素基因产物检测。以兔抗GST-Tri101抗体作为一抗，羊抗兔IgG-HRP为二抗，与含有Tri101蛋白的待检测物进行Western blot分析。本发明的Tri101基因编码单端孢霉烯3-O-乙酰转化酶，在大肠杆菌中对其进行了高效表达，将纯化的蛋白免疫新西兰白兔，得到特异性较好的抗体，并能与在BL21(DE3)中分泌表达的Tri101蛋白发生免疫印迹反应，为转入小麦和玉米中的Tri101基因提供一种新的检测方法，降低了检测成本，并为进一步研究Tri101蛋白的生物学功能奠定了坚实的基础。

主权项

一种降解赤霉病菌毒素的Tri101基因表达产物的检测方法，其特征在于，以兔抗GST‑Tri101抗体作为一抗，羊抗兔IgG‑HRP为二抗，与含有Tri101蛋白的待检测物进行Western blot分析；所述兔抗GST‑Tri101抗体的制备，是将纯化的GST‑Tri101融合蛋白作为抗原，注射健康新西兰大白兔制备出兔抗GST‑Tri101抗体，其中，(1)GST‑Tri101融合蛋白抗血清的制备包括以下步骤：①选取14‑16周龄的健康新西兰大白兔，每次注射180μg左右纯化的GST‑Tri101融合蛋白抗原，在免疫前，从兔耳抽取血样，作为阴性对照；②GST‑Tri101融合蛋白抗原500μL，加500μL福氏完全佐剂乳化，皮下多点注射免疫；③3周后，GST‑Tri101融合蛋白抗原500μL，加500μL福氏不完全佐剂乳化，腿部肌肉多点注射免疫；④2周后，500μL GST‑Tri101融合蛋白抗原免疫；⑤1周后，再次用1mL GST‑Tri101融合蛋白抗原加强免疫，同时，从兔耳抽血样，采用间接ELISA进行多抗血清效价测定；⑥1周后，杀兔收集血液，收集的血液置室温下凝固；⑦将凝固的血液放入37℃温箱内半小时，再置4℃冰箱过夜，使血块收缩，抗血清析出；⑧吸出抗血清，3000rpm离心10min，吸上清液分装，‑70℃保存备用；(2)GST‑Tri101融合蛋白抗血清的纯化包括以下步骤：①用pH值为7.4的PBS溶液将血清稀释2倍；②搅拌下逐滴加入饱和硫酸铵溶液，其pH值为7.4，使其饱和度达到50％，4℃静置2小时以上；③在4℃条件下，以12000rpm离心20min，将其沉淀溶于2倍的PBS溶液中；④加入饱和硫酸铵溶液，其pH值为7.4至溶液饱和度达到33％，4℃静置2小时以上；⑤在4℃条件下，以12000rpm离心20min，沉淀用少量的PBS溶液溶解；⑥在4℃条件下，在大于20倍体积的PBS溶液中透析24小时，中间更换透析液3次；⑦收集透析液，‑20℃保存备用。