[发明专利]悬浮共培养将人参总DNA导入马铃薯单细胞的方法

摘要

一种悬浮共培养将人参总DNA导入马铃薯单细胞的方法，该方法包括如下步骤：马铃薯细胞悬浮培养物的培养；分离悬浮细胞中的单细胞；将人参总DNA与马铃薯单细胞悬浮共培养；获得试管苗，经培养获得种薯。本发明方法获得的马铃薯后代块茎中含有人参皂苷RB1，且氨基酸、蛋白质含量大幅度提高，而其他性状并没有因为块茎蛋白质含量和质量的提高而变化。

主权项

一种悬浮共培养将人参总DNA导入马铃薯单细胞的方法，其特征在于：该方法包括如下步骤：(1)、马铃薯细胞悬浮培养物的培养：将长为0.8‑1.2cm的马铃薯茎段灭菌后接种到置放有诱导培养基的三角瓶中，每瓶接种6‑7块，该诱导培养基是MS+NAA0.4mg/L+6‑BA 2mg/L+蔗糖30g/L+琼脂8g/L，培养条件是：温度25‑28℃，光照3000Lux，光照时间12‑14h/d，培养10天；再继代培养5天，继代次数为1次，选取茎段两侧膨大显著、茎段中部增粗、外观疏松、颜色呈亮黄色的愈伤组织作为悬浮细胞，转移到液体悬浮培养基：MS+NAA 0.4mg/L+6‑BA 2mg/L+蔗糖30g/L中，在摇床100‑120转/min，25‑28℃，黑暗条件下，培养3‑5天后，将三角瓶壁上的细胞全部刮取下来，移入到体积比为2∶1的新旧混合的液体悬浮培养基：MS+NAA 0.4mg/L+6‑BA 2mg/L+蔗糖30g/L中，继代悬浮培养2‑4天，继代次数为1次；(2)、分离悬浮细胞中的单细胞：先选用孔径为30目细胞筛过滤除去细胞悬浮培养物中的大愈伤组织，再根据镜检观测的细胞大小选用孔径为60‑120目的第二层细胞筛滤去小细胞团，然后选用孔径为300目的第三层细胞筛得到分散的单细胞悬浮液，最后选用孔径为400目细胞筛过滤除去悬浮液中的杂质，得到马铃薯单细胞；(3)、人参总DNA与马铃薯单细胞悬浮共培养：获得人参总DNA，人参总DNA的浓度为350‑400ug/ml；将人参总DNA与马铃薯单细胞悬浮共培养，培养条件为摇床120‑150转/min，温度25‑28℃，培养液为MS+NAA 0.5mg/L+6‑BA 2mg/L+蔗糖40g/L，黑暗培养6‑8天；(4)、获得试管苗，经培养获得种薯：将共培养后的马铃薯单细胞转到MS+NAA0.05mg/L+6BA 2.0mg/L+GA35.0mg/L+蔗糖30g/L+琼脂8g/L的培养基上诱导单细胞不定芽分化，培养条件为：温度25‑28℃，光照3000Lux，光照时间14‑16h/d，将分化出的不定芽转到1/2MS+NAA 0.2mg/L+蔗糖30g/L+琼脂8g/L的培养基上诱导生根培养，培养条件为：温度25‑28℃，光照3000Lux，光照时间14‑16h/d，获得试管苗，进行RAPD分子检测，筛选出含有马铃薯对照体和人参供体相同条带的试管苗作外植体再诱导愈伤组织并分化、生根培养成苗，经培养获得种薯。