[发明专利]一种基因突变的检测方法

摘要

一种基因突变的检测方法,主要是针对等位基因特异引物PCR扩增法的缺点，利用分子克隆技术，事先分别构建含待检基因野生型和突变型的重组质粒，以此重组质粒为阳性模板，筛选确定特异地分别与3'末端突变位点或野生位点碱基互补的两条特异引物，一旦筛选出的特异引物序列，将是我们检测体系的关键元素。我们将以重组质粒为阳性模板，制备定量标准曲线，从而对待检标本进行准确定量。本发明的产品，可用于任何型号的荧光定量PCR仪，试剂成本同如今市面上的荧光定量PCR试剂相当，因此较好地克服了等位基因特异引物PCR扩增法的不足。

主权项

1.一种基因突变的检测方法，其过程如下，——从组织、排泄物和外周血中分别提取DNA，测定其浓度，保存于-20℃备用；——将筛选出的突变特异性引物同目标基因相对的下游引物配对，与含荧光染料或特异性荧光探针的PCR反应体系混合，分装至PCR反应管中，每管加入0.001～0.1微克DNA，前者系从外周血中提取的DNA，而后者为从组织、排泄物中提取的DNA，每管的反应体系为从10～50；——将待检的多种突变位点的反应管，放置于常规的荧光定量PCR仪上，反应条件设定为95℃1min 预变性, 95℃15sec 60℃1min 共40个循环；——反应结束后进行结果分析，凡出现标准的S型曲线者，判为阳性；其特征在于：所述的突变特异性引物的具体筛选过程如下：——设计外围引物及PCR扩增：首先在待检基因突变点或SNP位点的上下游，设计一对PCR扩增引物A和B，然后用引物A和B，对目的基因进行常规的PCR反应；——克隆PCR产物：将扩增出的PCR产物，利用AT克隆或酶切的方法，重组到普通的T载体质粒或含相同酶切点的质粒中，得到重组质粒； ——构建重组突变体：采用分子克隆技术，将突变体的序列，构建至上述得到的重组质粒中；——设计及筛选突变位点特异性引物：设计两条基因突变位点特异引物，一条引物C的3’端同突变序列互补，另一条引物D的3’端同正常序列互补；然后分别用基因突变位点特异引物C或D和对应的常规PCR引物B以上述构建好的重组野生型质粒作为反应模板，利用荧光定量PCR仪，对反应体系，进行筛选；其中，按照所加样品量为0.1微克全基因组DNA的标准进行筛选，其具体的筛选内容如下：（a）设定PCR反应条件：首先设定PCR反应的退火温度完全一致，具体温度为55℃～65℃，PCR循环次数为40次，PCR反应的酶和缓冲体系均优化后固定不变；（b）特异性筛选：采用突变型的引物以野生型的重组质粒为模板，筛选出的引物其Cq大于40；（c）敏感性筛选：将筛选出的特异性引物用与重组突变型质粒作敏感性试验，将检测灵敏度小于10个拷贝的特异性引物筛选出来，即为所需的突变特异性引物。