[发明专利]利用生物柴油副产物生产琥珀酸和聚羟基脂肪酸酯的方法

摘要

本发明公开了一种利用重组大肠杆菌发酵生物柴油副产物生产琥珀酸和聚羟基脂肪酸酯的方法。本发明通过在同一大肠杆菌中构建同时利用甘油和脂肪酸(C8-C18)的途径，实现了对生物柴油产业中的副产物甘油和脂肪酸的发酵利用，获得了高附加值的化工原料琥珀酸和生物材料聚羟基脂肪酸酯(PHA)；实验表明：本方法在积累25.3g/L～26.1g/L的琥珀酸的同时，PHA积累达到了细胞干重的3.42％～4.13％，为降低生物柴油产业的污染和成本，实现生物柴油产业中琥珀酸和PHA的低成本、高效率的联产开辟了新的途径。

主权项

利用生物柴油副产物生产琥珀酸和聚羟基脂肪酸酯的方法，步骤包括：(1)构建好氧发酵琥珀酸的大肠杆菌；(2)在构建的好氧发酵琥珀酸的大肠杆菌中构建聚羟基脂肪酸酯发酵途径；获得可同时生产琥珀酸和聚羟基脂肪酸酯的重组大肠杆菌；或者：(1)在大肠杆菌中构建聚羟基脂肪酸酯合成途径；(2)在构建的聚羟基脂肪酸酯合成途径的大肠杆菌中构建好氧发酵琥珀酸的途径；获得可同时生产琥珀酸和聚羟基脂肪酸酯的重组大肠杆菌；(3)利用构建的重组大肠杆菌发酵生物柴油副产物生产琥珀酸和聚羟基脂肪酸酯；其特征是：步骤(1)所述构建好氧发酵琥珀酸的大肠杆菌的方法是：通过Red重组系统在大肠杆菌E.coli中敲除中长链脂肪酸代谢阻遏物基因(fadR)、短链脂肪酸代谢阻遏物基因(atoC)、碳源代谢途径中的磷酸转移酶系统II(ptsG)、琥珀酸脱氢酶基因(sdhA)及乙酸生成途径(Pta‑ackA)，构建好氧产琥珀酸的大肠杆菌菌株E.coliΔfadRΔatoCΔptsGΔsdhAΔpta；步骤(2)所述在构建的好氧发酵琥珀酸的大肠杆菌中构建聚羟基脂肪酸酯发酵途径的方法是：将来源于假单胞菌属(Pseudomonas)的聚羟基脂肪酸酯合成酶基因phaC克隆至质粒pBluescript SK‑、pUC18、pUC19、pCL1920或pTrc99‑A中获得聚羟基脂肪酸酯表达重组质粒p‑phaC，并转化大肠杆菌琥珀酸发酵菌株E.coliΔfadRΔatoCΔptsGΔsdhAΔpta中，获得联产琥珀酸和聚羟基脂肪酸酯的重组大肠杆菌E.coliΔfadRΔatoCΔptsGΔsdhAΔpta/p‑phaC；或者：步骤(1)所述在大肠杆菌中构建聚羟基脂肪酸酯发酵途径的方法是：将来源于假单胞菌(Pseudomonas)的聚羟基脂肪酸酯合成酶基因phbC克隆至质粒pBluescript SK‑、pUC 18、pUC 19、pCL 1920或pTrc99‑A中获得聚羟基脂肪酸酯表达重组质粒p‑phaC，并转化大肠杆菌E.coli，得含聚羟基脂肪酸酯发酵途径的大肠杆菌E.coli/p‑phaC；步骤(2)所述在构建的聚羟基脂肪酸酯合成途径的大肠杆菌中构建好氧发酵琥珀酸的途径的方法是：通过Red重组系统在含聚羟基脂肪酸酯发酵途径的大肠杆菌E.coli/p‑phaC中敲除中长链脂肪酸代谢阻遏物基因(fadR)、短链脂肪酸代谢阻遏物基因(atoC)、碳源代谢途径中的磷酸转移酶系统II(ptsG)、琥珀酸脱氢酶基因(sdhA)及乙酸生成途径(Pta‑ackA)，获得联产聚羟基脂肪酸酯和琥珀酸的重组大肠杆菌E.coliΔfadRΔatoCΔptsGΔsdhAΔpta/p‑phaC；步骤(3)所述利用构建的重组大肠杆菌发酵生物柴油副产物生产琥珀酸和聚羟基脂肪酸酯的发酵条件是：摇瓶：温度设为30～40℃，摇床转速设为150～300转/分，发酵时间48h～72h；发酵罐：温度设为30～40℃，溶氧控制在50％以上，pH 6.5～7.5，发酵时间72h～150h。