[发明专利]一种胃液中miRNA的检测方法

摘要

本发明公开了一种胃液中miRNA的检测方法，包括胃液抽取和中和、RNA释放、氯仿提取、异丙醇沉淀、乙醇洗涤、RNA逆转录、PCR检测等步骤，该检测方法使用氢氧化钠溶液，对胃液中的粘稠成分进行液化使粘蛋白和多糖悬于溶液中，并中和胃液；加入胰蛋白酶进行消化，可以使粘蛋白等蛋白质水解，同时使胃液中的细胞成分变得松散，便于离心分离；加入Trizol溶液反复吹打，RNA充分释放并与多糖和粘蛋白等杂质分离，解决了胃液中酸度、多糖和粘蛋白等对RNA提取的干扰问题，因此本发明可以去除胃液中多糖和蛋白质等杂质干扰，对胃液中miRNA的有效提取，并对提取的miRNA进行荧光定量PCR检测。

主权项

一种胃液中miRNA的检测方法，其特征在于包括下述步骤：a、胃液抽取和中和：用胃管抽取空腹胃液5ml，放入离心管中，置于冰上，然后加入质量百分浓度为20%的氢氧化钠溶液0.5ml，置摇床中常温振摇20分钟，用质量百分浓度为20%的氢氧化钠溶液调整pH值至7.0±0.5，再加入质量百分浓度为1%的胰蛋白酶溶液20μl，漩涡混匀，置37℃水浴箱中消化15分钟，4℃下，1000rpm离心20分钟；b、RNA释放：取步骤a的上清液200μl置于消毒离心管中，加入50μl灭菌的焦碳酸乙二酯处理过的双蒸水，混匀，再加入Trizol溶液1ml，反复吹打20次，室温下静置10分钟， 4℃下，12000rpm离心15分钟；c、氯仿提取：将步骤b的上清液移入另一消毒离心管中，加入0.2ml氯仿，漩涡振荡15秒，室温下静置5分钟，4℃下，12000rpm离心15分钟，吸取上层水相移入焦碳酸乙二酯处理过的灭菌离心管中；d、异丙醇沉淀：在步骤c的灭菌离心管中加入与所述上层水相等体积的异丙醇，混匀，室温下静置20分钟，4℃下，12000rpm离心15分钟，弃上清得沉淀；e、乙醇洗涤：在步骤d的沉淀中，加入质量百分浓度为75%的乙醇1ml，颠倒混匀20次洗涤，4℃下，12000rpm离心3分钟，弃上清，再用同浓度和同量的乙醇同样重复洗涤一次，4℃下，12000rpm离心3分钟，弃上清，室温下干燥10分钟，加15μl双蒸水溶解，得到RNA提取液，‑80℃保存备用；f、RNA逆转录：用miScript 逆转录试剂盒对步骤e的RNA提取液进行逆转录反应，得到cDNA溶液，置‑20℃保存备用，具体操作依该试剂盒说明书进行；g、PCR检测：用miScript SYBR Green PCR检测试剂盒对步骤f的cDNA溶液进行PCR扩增反应，扩增的上游引物为miRNA特异性扩增上游引物或小RNA U6特异性扩增上游引物，扩增的下游引物为小RNA通用下游引物，再用荧光定量PCR仪检测，具体操作依检测试剂盒和荧光定量PCR仪说明书进行。