[发明专利]脂质体介导构建表达hPEPT2的海拉细胞方法

摘要

本发明公开一种脂质体介导构建表达hPEPT2的海拉细胞方法，是用脂质体转染法将hPEPT2的质粒转入海拉细胞中，并筛选出稳定转染的细胞。操作简单，没有免疫原性，对细胞没有毒副作用，重复性好，hPEPT2基因转染效率高达30～40％。

主权项

一种脂质体介导构建表达hPEPT2的海拉细胞方法，其特征在于按如下步骤进行：a.将处于对数生长期的海拉细胞用0.25％胰蛋白酶‑0.02％EDTA混合消化液制成单细胞悬液；b.将单细胞悬液接种于6孔培养板上，接种密度为5*105/ml，在细胞转染前，将培养液更换为无血清、无双抗的DMEM培养液；c.制备脂质体转染试剂/hPEPT2质粒DNA复合物；d.当海拉细胞融合度达到60～70％时，将6孔板中的海拉细胞用D‑Hanks冲洗后，再加入2ml无血清、无双抗的DMEM培养液；6孔板的每个单孔中均逐滴加入500μl脂质体转染试剂/hPEPT2质粒DNA复合物，摇动培养板，轻轻混匀，置于37℃，5％的CO2，相对湿度90％的细胞培养箱中6小时，更换含有血清、无双抗的DMEM培养液，重新置于37℃，5％的CO2，相对湿度90％的细胞培养箱中培养48h，完成细胞转染；e.用浓度为1g/ml的G418配制含有血清无双抗的DMEM培养液，0.22μm滤膜过滤，4℃保存；取空质粒转染的海拉细胞接种于24孔细胞培养板中，细胞密度1000个/ml，将培养液同时更换为至少6个梯度含G418的有血清无双抗DMEM培养液，每孔2ml，置于37℃，5％的CO2，相对湿度90％的细胞培养箱中培养；每3天更换相应浓度G418有血清无双抗DMEM培养液，以在10～14天内能够杀死所有细胞的最小G418浓度为筛选浓度标准，以紧邻筛选浓度标准的高一梯度G418浓度作为筛选浓度；f.将d步骤所得完成细胞转染的细胞传代于新6孔板中，加入筛选浓度的含G418的有血清无双抗DMEM培养液，待细胞集落形成后，采用挑单克隆技术，将筛选后的细胞转移至24孔板中，置于37℃，5％的CO2，相对湿度90％的细胞培养箱中培养。