[发明专利]扩增双链DNA中的双链目的序列的方法

摘要

本发明涉及具有高特异性的巢式PCR。本发明提供扩增目的序列1的方法，该方法可高效扩增单链目的序列，以及可显著抑制非特异性扩增。本发明的一实施方式中，在巢式PCR的第2阶段，混合与外侧正向引物(4of)互补、且不会为所述DNA聚合酶引发的DNA延伸反应提供起点的外侧正向封闭核酸(4ofb)。

主权项

一种扩增由第1单链DNA(6)及第2单链DNA(7)构成的双链DNA中的双链目的序列(1)的方法，其中，所述双链目的序列(1)由单链目的序列(1a)及互补性单链目的序列(1b)构成，所述第1单链DNA(6)由3′末端‑第1非扩增序列(6a)‑第2非扩增序列(6b)‑所述单链目的序列(1a)‑第3非扩增序列(6c)‑第4非扩增序列(6d)‑5′末端构成，所述第2单链DNA(7)由5′末端‑第5非扩增序列(7a)‑第6非扩增序列(7b)‑所述互补性单链目的序列(1b)‑第7非扩增序列(7c)‑第8非扩增序列(7d)‑3′末端构成，所述互补性单链目的序列(1b)、所述第5非扩增序列(7a)、第6非扩增序列(7b)、第7非扩增序列(7c)、及第8非扩增序列(7d)分别与所述单链目的序列(1a)、所述第1非扩增序列(6a)、所述第2非扩增序列(6b)、所述第3非扩增序列(6c)及所述第4非扩增序列(6d)互补；所述方法包括以下的工序A及工序B：混合DNA聚合酶、脱氧核糖核苷三磷酸、所述双链DNA(6、7)、及外侧正向引物(4of)、及外侧反向引物(5or)，利用聚合酶链反应扩增中间双链DNA的工序A，其中，所述中间双链DNA由中间目的序列及互补性中间目的序列构成，所述中间目的序列由3′末端‑第2非扩增序列(6b)‑所述单链目的序列(1a)‑第3非扩增序列(6c)‑5′末端构成，所述互补性中间目的序列由5′末端‑第6非扩增序列(7b)‑所述互补性单链目的序列(1b)‑第7非扩增序列(7c)‑3′末端构成，所述外侧正向引物(4of)与所述第2非扩增序列(6b)中所含3′末端侧的序列部分互补，所述外侧反向引物(5or)与所述第7非扩增序列中所含3′末端侧的序列部分互补；以及混合DNA聚合酶、脱氧核糖核苷三磷酸、所述中间双链DNA、内侧正向引物(4if)、内侧反向引物(5ir)、及外侧正向封闭核酸(4ofb)，利用聚合酶链反应来特异性扩增所述目的序列1的工序B，其中，所述内侧正向引物(4if)与所述单链目的序列(1a)中所含3′末端侧的序列部分互补，所述内侧反向引物(5ir)与所述互补性单链目的序列(1b)中所含3′末端侧的序列部分互补，所述外侧正向封闭核酸(4ofb)与所述外侧正向引物(4of)互补，且不能成为所述DNA聚合酶引发的DNA延伸反应的起点。