[发明专利]在固相利用单一标记固定化探针及外切核酸活性的靶核酸序列检测

摘要

本发明涉及一种在固相利用单一标记固定化探针且通过反复性外切核酸反应或者外切核酸反应检测靶核酸序列的新颖的方法。在本发明中，能够利用单一标记系统在固相检测靶核酸序列。对于探针设计及制备而言，利用单一标记探针的本发明与如双重标记法的多重标记系统相比，在方便性及有成本效益方面具有非常卓越的优点。并且，在本发明中反应期间的信号减少变化测定会引发更加准确的靶核酸序列的定性分析及定量分析。

主权项

一种在固相上、在不使用上游引物的情形下通过反复性外切核酸反应(CER)从核酸混合物检测靶核酸序列的方法，其特征在于，包括如下步骤：步骤(a)，将所述靶核酸序列与固定化探针进行杂交；所述固定化探针包含：核苷酸序列，其与所述靶核酸序列互补，以及单一标记，用于产生能够检测的信号；所述固定化探针通过其3’‑末端在固相基质上实现固定化；步骤(b)，在切割所述固定化探针的条件下，使所述步骤(a)的结果物与具有5’→3’外切核酸酶活性的热稳定性酶相接触；所述固定化探针由具有5’→3’外切核酸酶活性的所述热稳定性酶所切割，使得所述单一标记从所述固定化探针分离，来引起在所述固相基质上的信号减少，其中具有5’→3’外切核酸酶活性的热稳定性酶是具有5’→3’外切核酸酶活性的模板依赖性核酸聚合酶；步骤(c)，使所述步骤(b)的结果物得到变性；步骤(d)，在不使用上游引物的情形下，至少反复进行两次所述步骤(a)‑步骤(c)，进而使所述固相基质上的所述信号减少；以及步骤(e)，检测所述固相基质上的所述信号减少；通过所述固定化探针的切割而引发的所述信号减少表示所述靶核酸序列的存在，其中所述上游引物是定位于固定化探针的5’末端的上游的引物，并且能够借助模板依赖性核酸聚合酶来延伸；其中所述固定化探针不是具有由下述通式I代表的被修饰双重特异性寡核苷酸(mDSO)结构的靶区分性探针(TD探针)，该探针允许将靶核酸序列与非靶核酸序列区分开来：5’‑X’p‑Y’q‑Z’r‑3’    (I)其中,X'p代表5'‑第二杂交部分，其具有与靶核酸序列互补的杂交核苷酸序列；Y'q代表包含至少三个通用碱基的隔离部分；Z'r代表具有与所述靶核酸序列互补的杂交核苷酸序列的3'‑第一杂交部分；p、q和r代表核苷酸数目；并且X'、Y'和Z'是脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸；所述5’‑第二杂交部分的Tm值低于所述3’‑第一杂交部分的Tm值，并且在X'p,Y'q和Z'r三个部分中所述隔离部分具有最低的Tm值；所述隔离部分在与靶核酸序列的杂交事件中将5’‑第二杂交部分与3’‑第一杂交部分隔开，从而TD探针的杂交特异性被5’‑第二杂交部分和3’‑第一杂交部分双重地确定，使得所述TD探针的总体杂交特异性被增强；其中，当所述TD探针与靶核酸序列杂交时，5’‑第二杂交部分和3’‑第一杂交部分二者与靶核酸序列杂交；其中，当所述TD探针与非靶核酸序列杂交时，所述5’‑第二杂交部分和隔离部分二者均形成单链，由此所述TD探针允许将所述靶核酸序列与所述非靶核酸序列区分开来。