[发明专利]基于表面等离激元共振的HPRT体基因突变检测方法

摘要

本发明属于一种酶的定量检测方法，具体基于表面等离激元共振的HPRT体基因突变检测方法。一种基于表面等离激元共振的HPRT体基因突变检测方法，其特征在于如下步骤实现：野生型HPRT酶敏感SPR金膜的制备：野生型HPRT标准品的SPR检测（3）样品制备及SPR检测将收集的哺乳动物细胞用hanks液反复清洗后，直接加入组织细胞裂解液，4℃条件下振荡，使样品裂解充分，裂解产物低温离心，收集含有蛋白质的上清液；将上清液中裂解液成分用PBS置换后，4℃冰箱保存，SPR检测。本方法的检测灵敏度高，可以检测ngmL-1数量级的野生型HPRT含量。

主权项

一种基于表面等离激元共振的HPRT体基因突变检测方法，其特征在于如下步骤实现：（1）野生型HPRT酶敏感SPR金膜的制备：  Pirrahan溶液清洗SPR金膜15s；20 mM的半胱氨酸覆盖于清洗过的金膜表面，然后将金膜避光放置过夜；过夜后的金膜经蒸馏水彻底清洗以去除没有结合的半胱氨酸，氮气吹干；半胱氨酸修饰的金膜表面再覆盖以10 mg/ml羧甲基葡聚糖，15mM N‑羟基琥珀酰亚胺NHS和75 mM 1‑乙基‑3‑(3‑二甲胺基丙基)碳二亚胺盐酸盐EDC的混合液，避光放置2.5小时；2.5小时后，蒸馏水冲洗并氮气吹干；经蒸馏水冲洗3次后，放入6‑硫代鸟嘌呤0.3 mg/ml的溶液中，通过酰胺键化学偶联反应，将6‑硫代鸟嘌呤固定在金膜表面，1M的乙醇胺100 ul封闭未与6‑硫代鸟嘌呤结合的羧甲基葡聚糖，取出金膜经蒸馏水冲洗得到6‑硫代鸟嘌呤敏感SPR金膜，这种敏感金膜放置在4℃冰箱保存备用一周；（2）野生型HPRT标准品的SPR检测：从低到高将不同浓度的野生型HPRT分别取100ul注入SPR仪器的进样器，记录SPR共振角度随时间变化的过程并根据SPR信号的标准差计算SPR仪器检测HPRT的最低检测限；（3）样品制备及SPR检测：将收集的哺乳动物细胞用hanks液反复清洗后，直接加入组织细胞裂解液，4℃条件下振荡，使样品裂解充分，裂解产物低温离心，收集含有蛋白质的上清液；将上清液中裂解液成分用PBS置换后，4℃冰箱保存，SPR检测。