[发明专利]眼袋脂肪间质细胞的分离保存及其培养扩增方法

摘要

眼袋脂肪间质细胞的分离保存方法，采用手术刀切除获取眼袋脂肪组织，摘取其中间质组织，并用贴壁法分离细胞。眼袋脂肪间质细胞培养扩增方法，采用纸载体技术大规模培养组织，使用成分明确无异基因组分冻存并长期保存细胞。此分离保存方法可以提取眼袋间质细胞，大量培养并长期保存，培养出来的间质细胞可用于促进皮肤创面愈合、促进糖尿病溃疡愈合、促进心肌损伤的修复、促进肝功能损伤的修复。

主权项

眼袋脂肪间质细胞的分离保存方法，其特征在于：1)、在净化工作台下，将眼袋脂肪组织从无菌容器中移出，放入无菌器皿中；2)、加入无菌的且含有抑菌剂的渗透压为270‑330mOsm/kg的磷酸盐缓冲溶液，轻轻冲洗后，移出磷酸盐缓冲溶液；3)、用手术剪快速将组织剪碎，尽量剔除黄色部分，直至组织块大小约2mm×2mm×2mm；4)、再次加入磷酸盐缓冲溶液重悬组织块，200g‑300g离心5分钟，弃去上层磷酸盐缓冲溶液，选取下层沉淀组织块备用；5)、取6孔‑24孔培养板，每孔用眼科镊植入一枚至多枚组织块，用盖玻片加压盖住，加入少量贴壁培养基至润湿底面；6)、按24孔板计算，每孔加入已配制完全的间充质干细胞培养液0.3‑0.5ml，在36‑38℃1％‑5％CO2条件下培养48h后，每孔再加入0.3‑0.5ml已配制完全的间充质干细胞培养液，每3天半量换液一次；7)、组织块植入约3天，当组织块周围可见有散在的长梭形细胞时，每3天半量换液一次；8)、至每孔培养的原代细胞增至70％～80％融合；9)、移出培养板中的培养基，每孔加入1‑1.5ml无菌磷酸盐缓冲溶液，用吸管吸取磷酸盐缓冲溶液轻柔的冲洗培养层，移去磷酸盐缓 冲溶液，重复一次；10)、每孔加入0.2ml消化液，使充分浸润后轻摇培养瓶，约1‑3分钟，肉眼观察瓶壁半透明的细胞层，当见到出现细针孔空隙时，弃去消化液，并加入1ml完全培养基终止消化；11)、用吸管吸取细胞悬液，轻柔的冲洗培养层后，收集细胞悬液于无菌容器中，混匀，取样细胞计数；12)、取300g，在4℃温度条件下，离心5min后，弃去上清液；13)、采用差速贴壁法，弃去30分钟内的贴壁细胞，未贴壁细胞继续贴壁培养，弃去1小时内未贴壁的细胞；14)、筛选出的贴壁细胞采用密度为1.073g/ml‑1.077g/ml的淋巴细胞分离液，采用密度梯度离心法离心；15)、将分层筛选出的细胞用10ml间充质干细胞培养基吹打混匀，传入2个T75培养瓶，每个培养瓶中补足5ml间充质干细胞培养基，在37℃、5％CO2条件下培养；16)、传代细胞生长至亚汇合状态；17)、使用含有7％‑10％的二甲基亚砜组分的冻存液冻存脂肪间质细胞。