[发明专利]基于绿色荧光蛋白检测乳酸菌在胃肠道中定植特性的方法

摘要

本发明涉及一种基于绿色荧光蛋白检测乳酸菌在胃肠道中定植特性的方法。提供带有荧光蛋白的乳酸菌表达载体(比如pMG36e-nisI-gfp)用于使乳酸菌自身表达绿色荧光蛋白，该载体含有nisin抗性基因nisI和绿色荧光蛋白基因gfp。将该载体转化乳酸菌，转化子自身能够表达绿色荧光蛋白。将转化菌株饲喂昆明小鼠，通过跟踪监测荧光菌体在小鼠消化道各段的情况来准确分析乳酸菌在动物消化道各段中的定植、黏附状况。本发明提供的方法可应用于多种乳酸菌，不受细菌型别和种类的限制，也不受细菌生长环境的限制，可广泛应用于科研、生产等各种领域，有望成为乳酸菌口服疫苗的表达载体。

主权项

一种表达绿色荧光蛋白的乳酸菌LAB‑GFP，其特征在于由以下方法构建：(1)设计引物N1和N2，以pLEB590为模板，扩增出编码nisin抗性基因nisI片断，其中N1序列为：N1：5’‑AGATCTAGACAGGAGGGAAGAGGAAATGAG‑3’并附有内切酶位点(比如下划线为XbaI酶切位点)；N2序列为：N2：5’‑CGTCTGCAGTTAGGATCCCTAGTTTCCTAC‑3’并附有内切酶位点(比如下划线为PstI酶切位点)；(2)采用内切酶酶切，比如将nisI片断纯化后，用XbaI和PstI进行双酶切；(3)经双酶切后的nisI片断与经相同酶切处理的pMG36e在T4DNA连接酶的作用下进行连接，连接液电转化至乳酸菌感受态；(4)取转化菌液涂布在含红霉素和nisin的GM17平板上，30℃培养48～72h后，挑单克隆至含红霉素和nisin的液体GM17培养基中培养，提取质粒进行单酶切和PCR鉴定，将阳性重组子命名为pMG36e‑nisI；(5)设计引物G1和G2，以pGFP为模板，扩增出编码绿色荧光蛋白基因gfp片断，其中G1序列为：G1：5’‑GCGAGCTCATGAGTAAAGGAGAAGAACT‑3’并附有内切酶位点(比如下划线为SacI酶切位点)；G2序列为：G2：5’‑GCTCTAGACGCGGTACCTTTGTATAG‑3’并附有内切酶位点(比如下划线为XbaI酶切位点)；(6)将gfp片断纯化后，用内切酶进行双酶切(如XbaI和SacI)；(7)经双酶切后的gfp片断与经相同酶切处理的pMG36e‑nisI在T4DNA连接酶的作用下进行连接，连接液电转化至乳酸菌感受态；(8)取转化菌液涂布在含红霉素和nisin的GM17平板上，30℃培养48～72h后，挑单克隆至含红霉素和nisin的液体GM17培养基中培养，提取质粒进行单酶切和PCR鉴定，将阳性重组子载体命名为pMG36e‑nisI‑gfp，阳性菌株命名为LAB‑GFP。