[发明专利]一种农杆菌介导的胚性愈伤转化培育石竹转基因植株的方法

摘要

本发明属于观赏植物转基因技术领域，具体地，本发明涉及石竹转基因植株的培育方法。公开了一种农杆菌介导的，以石竹胚性愈伤为材料培育转基因石竹的方法，其步骤包括胚性愈伤的诱导、遗传转化、筛选再生、GUS染色检测和PCR检测。其特征在于，通过农杆菌介导将GUS报告基因和ACO目的基因导入受体石竹胚性愈伤中，对影响胚性愈伤转化的不同因素进行筛选，利用卡那霉素或潮霉素作为选择剂，对转化后的胚性愈伤进行筛选，通过GUS染色，PCR检测等辅助方法筛选得到转基因石竹植株。本发明为石竹遗传转化创新种质资源提供了新的技术平台。

主权项

一种农杆菌转化石竹胚性愈伤的方法，其步骤包括胚性愈伤诱导、遗传转化和植株鉴定，其特征在于，采用石竹花瓣或花丝为材料诱导胚性愈伤，采用诱导出的胚性愈伤作为遗传转化受体材料，经农杆菌侵染、共培养、选择培养、分化培养和生根培养，将GUS报告基因或ACO目的基因导入胚性愈伤，利用卡那霉素或潮霉素对转化后的胚性愈伤进行筛选，通过GUS染色和PCR检测筛选得到转基因胚性愈伤和转基因植株；其步骤如下：1)将长度为7.0‑8.5cm的石竹花蕾，放入垫有湿润滤纸的培养皿内，置于4℃冰箱中冷藏处理4‑6d；2)胚性愈伤诱导：将步骤1)冷藏处理后的花蕾，灭菌后置于超净工作台上剥出花瓣及花丝，接种于胚性愈伤诱导培养基上，诱导胚性愈伤；3)侵染：将步骤2)诱导获得的胚性愈伤置于农杆菌菌液中进行侵染13‑15min，期间每2‑3分钟摇动一次；4)共培养：将步骤3)中胚性愈伤从农杆菌液中取出，用无菌滤纸吸干，接入共培培养基上；在26±1℃黑暗条件下培养4d；5)选择培养：将步骤4)中共培养后的胚性愈伤转入选择培养基上，筛选3次，每月更换一次新鲜选择培养基，得到抗性胚性愈伤；6)抗性芽分化及生根：将步骤5)得到的抗性胚性愈伤转移至分化培养基上诱导，得到抗性芽；将该抗性芽切下转移至生根培养基上使其生根，得到再生植株；7)对步骤6)所得的转GUS基因或ACO目的基因胚性愈伤和植株进行GUS化学染色和PCR检测，验证获得的转基因胚性愈伤和转基因植株；培养基组分及配比如下：胚性愈伤诱导培养基：MS，附加2，4‑D 2.0mg/L，6‑苄基氨基嘌呤1.0mg/L，蔗糖30g/L和琼脂7.0g/L；用蒸馏水定容至1L；pH5.8；胚性愈伤继代培养基：MS，附加蔗糖60g/L和琼脂7.0g/L；用蒸馏水定容至1L；pH5.8；共培培养基：MS，附加6‑苄基氨基嘌呤2.0mg/L，萘乙酸0.1mg/L；蔗糖60g/L；琼脂7.0g/L；乙酰丁香酮1000umol/L；用蒸馏水定容至1L；pH5.8；选择培养基‑1：MS，附加6‑苄基氨基嘌呤2.0mg/L；萘乙酸0.1mg/L；蔗糖60g/L；琼脂7.0g/L；卡那霉素50mg/L；头孢霉素400mg/L；用蒸馏水定容至1L；pH5.8；选择培养基‑2：MS，附加6‑苄基氨基嘌呤2.0mg/L；萘乙酸0.1mg/L；蔗糖60g/L；琼脂7.0g/L；潮霉素5mg/L；头孢霉素400mg/L；用蒸馏水定容至1L；pH5.8；分化培养基：MS，附加6‑苄基氨基嘌呤2.0mg/L；萘乙酸0.1mg/L；蔗糖60g/L；琼脂7.0g/L；用蒸馏水定容至1L；pH5.8；生根培养基：MS，附加活性炭0.2g/L，蔗糖60g/L和琼脂9.0g/L；用蒸馏水定容至1L。