[发明专利]大规模纯化含有HisTaq和甲酸水解位点的融合蛋白的方法

摘要

本发明公开了一种大规模纯化含有His Taq和甲酸水解位点的融合蛋白的方法与应用。该方法包括如下步骤：对表达含有His Taq和甲酸水解位点的融合蛋白的工程菌发酵液进行预处理，得到含有His Taq和甲酸水解位点的融合蛋白粗提物，通过Ni-NTA柱亲和层析和C18反向疏水柱脱盐，得到融合蛋白粗提物的初次纯化蛋白，接着甲酸水解，再通过Ni-NTA柱亲和层析和C18反向疏水柱脱盐，得到初级纯化的目的多肽，HPLC精制后可得纯度高于95％的目的多肽。本发明所述的方法有效地对含有His Taq和甲酸水解位点的融合蛋白进行大规模的制备，最终目的多肽的得率高、纯度高、耗时短、成本低，可达到g级别以上生产规模，可以满足动物实验以及临床前的实验研究。

主权项

一种大规模纯化含有His Taq和甲酸水解位点的融合蛋白的方法，其特征在于包括以下步骤：(1)对表达含有His Taq和甲酸水解位点的融合蛋白的工程菌发酵液进行预处理，得到含有His Taq和甲酸水解位点的融合蛋白粗提物：①含有His Taq和甲酸水解位点的融合蛋白为分泌形式表达时，则去除工程菌发酵液中的固体物质，收集发酵上清液，对发酵上清液进行浓缩；②含有His Taq和甲酸水解位点的融合蛋白为包涵体形式表达时，则收集工程菌菌体，进行破碎，然后将包涵体进行变性，溶解于溶液中；(2)融合蛋白粗提物的初次纯化A、用含10～20mM咪唑的溶解缓冲液A平衡Ni‑NTA柱至基线稳定，然后将步骤(1)得到的融合蛋白粗提物上柱，流速为3～6ml/min，Ni‑NTA柱的载量为25～35mg蛋白/ml柱体积；上柱完后，用含10～20mM咪唑的溶解缓冲液A洗柱子至基线，然后用含250～500mM咪唑的溶解缓冲液A洗脱至基线停止，收集蛋白峰处的洗脱液；最后用含1M咪唑的溶解缓冲液A冲洗Ni‑NTA柱至基线，将残留在柱上的蛋白和其它杂质全部洗脱下来，再用去离子水冲洗Ni‑NTA柱，Ni‑NTA柱得以重复利用；所述的溶解缓冲液A的组成为：6M尿素、25～50mM Na2HPO4、300～500mM NaCl，pH 8.0；B、将蛋白峰处的洗脱液过C18反向疏水柱进行脱盐处理，具体步骤如下：将蛋白峰处的洗脱液的pH值调为3～4，然后上脱盐平衡液平衡好的C18反向疏水柱；上柱的条件为流速5～14ml/min，载量6g融合蛋白/L柱体积；接着用体积百分比0.1％的三氟乙酸水溶液冲洗C18反向疏水柱至无盐；用脱盐洗脱液洗脱至基线为止，收集不在基线处的洗脱液，浓缩至原体积的1/5，真空冷冻干燥，得到初级纯化蛋白；所述的脱盐平衡液为三氟乙酸、乙腈、超纯水按照体积比0.1∶5∶94.9混合得到的溶液；所述的脱盐洗脱液为三氟乙酸、乙腈、超纯水按照体积比0.1∶50∶49.9混合得到的溶液；(3)甲酸水解释放目的肽用体积百分比为50％～60％的甲酸溶解初级纯化蛋白，初级纯化蛋白的终浓度为10～30mg/ml，于避光条件下、42～45℃的条件下振荡36～48h进行水解，水解后浓缩，真空冷冻干燥，得到甲酸水解蛋白；(4)目的多肽的初步纯化A、用含10～20mM咪唑的溶解缓冲液A平衡Ni‑NTA柱至基线稳定，将样品上柱，样品为用含10～20mM咪唑的溶解缓冲液A溶解的甲酸水解蛋白，且pH值为8.0；样品上柱量为2～3倍柱体积，流速为2～5ml/min；收集含有目的多肽的过柱液；B、用含10～20mM咪唑的溶解缓冲液A冲洗Ni‑NTA柱至基线，收集过柱液；C、将步骤A和B的过柱液合并，得到初步纯化的目的多肽；D、用含250～1mol/L咪唑的溶解缓冲液A冲洗Ni‑NTA柱至基线，再用去离子水冲洗Ni‑NTA柱，Ni‑NTA柱得以重复利用；(5)C18反向疏水柱脱盐处理初步纯化的目的多肽通过C18反向疏水柱进行脱盐处理，同步骤(2)B，差异仅在于流速为3～5ml/min；(6)目的多肽的精制，通过制备型的高效液相色谱进行制备HPLC的条件为乙腈的起始浓度为体积百分比10％，终止浓度为体积百分比60％，分管收集洗脱液；HPLC检测各管收集液，确定各管收集液中目的肽的纯度，合并纯度高于质量百分比95％的各管收集液，纯度低于95％的各管收集液可合并后再次用HPLC进行精制；真空冷冻干燥纯度高于95％的各管收集液合并液，得到纯度高于95％的目的多肽。