[发明专利]一种利用基因工程培育新型不育系的方法

摘要

一种利用基因工程培育新型细胞核雄性不育系的方法，属于作物分子育种技术领域。该方法利用转基因技术将35S启动子与隐性核不育基因以及抗除草剂基因连接，同时将诱导型启动子与恢复基因连接，将三类基因一并转入作物中。转基因的阳性株系在没有诱导条件下，表现为100%不育，通过调节诱导启动子的表达调节恢复基因活性变成可育。收获种子下代种植时，在没有诱导条件下，为全不育系，这样可以繁殖100%的隐性核不育系。不育系可与大量的其它材料（恢复系）杂交，配制杂交组合。本发明转化的阳性株系能够抗除草剂，在不育系转育过程中可以有效的去除纯合可育株，省时省力。应用本发明方法可以提高杂交种纯度、简化保持系的选育和传统不育系的培育程序，突破核不育系在作物杂种优势利用中的瓶颈。隐性核不育株在诱导下自交可育，后代全不育，繁殖不育系和制种均可。

主权项

一种利用基因工程培育新型不育系的方法，其特征在于，依次通过如下步骤实现：1）采用植物表达载体pCAMB1301作为甘蓝型油菜转基因载体，将35S启动子连接隐性核不育基因以及抗除草剂基因，再以诱导型启动子与等位恢复基因连接，构建三类组合基因的表达载体pCAMB1301；2) 连接产物转化大肠杆菌菌株DH10B，在含有卡拉霉素的LB培养基上筛选转化子，挑选单菌落提取质粒，阳性的重组质粒通过冻融法导入农杆菌菌株LBA4404，得到阳性工程菌株；3）采用常规的农杆菌介导法进行甘蓝型油菜遗传转化；4) T0代植株检测为阳性的单株观察育性表现，通过RT‑PCR和Southern杂交检测，确定阳性转基因隐性核不育单株；将成功导入不育基因的不育单株根据启动子类型苗期喷施化学试剂或光照处理，调节诱导型启动子，恢复基因表达，使不育变成可育单株，然后收获种子；5）不育系的转育：以成功导入目的基因的不育单株为母本、以甘蓝型油菜为父本杂交，回交出现育性分离， AA:Aa= 1：1的分离比，以除草剂喷施处理，杀死纯合的可育单株，留下杂合的可育株继续回交，重复若干代直至杂合可育株综合性状与轮回亲本相似，再将杂合不育株自交，将其中的不育单株作为大规模配制杂交组合的母本；6）将不育系转化为自身保持系：不育单株通过喷施化学诱导剂或光照处理，调节诱导型启动子，使不育株育性恢复，自交保留种子，第二年继续种植，在无诱导处理的情况下仍然表现不育；7）将不育株做母本，以具有恢复基因的材料做恢复系，按规常规制种流程配制杂交组合。