[发明专利]快速检测四种硝基呋喃类药物的免疫纳米金试纸条

摘要

本发明涉及一种快速检测四种硝基呋喃类药物的免疫纳米金试纸条，其是以5-硝基糠醛为原料，合成了针对呋喃西林、呋喃它酮、呋喃妥因和呋喃唑酮四种硝基呋喃类药物的通用半抗原以及免疫原和捕获抗原，然后通过免疫实验动物家兔获得多克隆IgG抗体，再用纳米金和多克隆IgG抗体制备金标抗体，将金标抗体溶液喷涂在Glass33型玻璃纤维素膜即结合释放垫上，捕获抗原和羊抗兔抗体分别涂在AE99型硝酸纤维素膜的检测线和质控线位置，然后依次将AE99硝酸纤维素膜、结合释放垫Glass33玻璃纤维素膜、吸收垫Cottonlinters2668和样品垫Glass33粘贴在PVC背板上，最后裁剪为4×50mm的试纸条。本发明能同时快速检测饲料中呋喃西林、呋喃它酮、呋喃妥因和呋喃唑酮四种药物，且该试纸条的成本价格低于5元，适合在饲料检测或食品动物检测中广泛应用。

主权项

一种快速检测四种硝基呋喃类药物的免疫纳米金试纸条，其特征在于其制备方法如下：（1）合成通用半抗原：称取5‑硝基糠醛50‑80mg溶于3‑5mL乙醇中得A液；称取硫酸联氨70‑100mg溶于5‑10mL蒸馏水中得B液；室温下将A液逐滴滴加到B液中，搅拌反应30‑60分钟，得黄色沉淀；用饱和碳酸钠溶液中和上述反应液至pH6.0‑8.0后，将此混和液抽滤至干；所剩固体用10‑20mL蒸馏水洗涤，再抽滤至干，自然干燥即得通用半抗原；（2）合成免疫原：称取所述半抗原10‑20mg 溶于5‑10mL甲醇中，搅拌条件下逐滴滴加到含牛血清白蛋白30‑50mg的浓度为0.01mol/L、pH7.0‑7.4磷酸缓冲液5‑10mL中；然后逐滴加入浓度为25%的戊二醛溶液60‑100μL，20‑25℃反应4小时即得免疫原溶液，然后在4℃生理盐水中透析72小时，透析液冷冻保存；（3）合成捕获抗原：称取所述半抗原10‑20mg 溶于5‑10mL甲醇中，冷却至4 ℃；然后，在4 ℃条件下用盐酸调节pH为1.0‑3.0，再逐滴加入0.2‑0.5mol/L的亚硝酸钠溶液1‑4mL，搅拌反应至淀粉碘化钾试纸检验呈灰蓝色为止；然后用氢氧化钠溶液调 pH至7.5‑9.0；将所得溶液逐滴加入到含卵清蛋白10‑20mg的浓度为0.01mol/L、pH7.0‑7.4的磷酸缓冲液5‑10mL中，4℃搅拌反应8‑16h即得捕获抗原溶液，然后在生理盐水中透析72小时，透析液冷冻保存；（4）制备多克隆IgG抗体：将所述免疫原用生理盐水稀释为1mg/mL，加与稀释后免疫原溶液等量的氟氏完全佐剂制成乳化剂，在实验动物家兔的背部皮内多点注射进行首免，免疫剂量0.2‑0.8mg/只；3‑4周后，取1mg/mL的免疫原溶液加与免疫原溶液等量的氟氏不完全佐剂乳化后在实验动物家兔背部皮下多点注射进行加强免疫，免疫剂量0.2‑0.8mg/只，每4周加强免疫一次，共免疫6‑8次；最后一次免疫，为免疫原直接耳缘静脉注射，免疫剂量0.2‑0.8mg/只；然后，取兔全血分离血清，采用饱和硫酸铵法对血清中的IgG进行粗提；粗提液在浓度0.01mol/L、pH7.0‑7.4的磷酸缓冲液中透析2‑3天以脱盐；透析液再用DEAE‑52层析柱进行纯化；纯化后的IgG溶液再在浓度0.01mol/L，pH7.0‑7.4的磷酸缓冲液中透析2‑3天以脱盐，即得多克隆IgG抗体溶液，最后冷冻保存；（5）制备纳米金溶液：取0.01%‑0.05%的氯金酸溶液100mL恒温搅拌加热至沸腾，在持续搅拌的情况下加入1%‑4%的柠檬酸三钠溶液1‑4mL，继续搅拌加热20‑30分钟，至溶液呈透亮红色，室温冷却，用去离子水恢复至100mL，即得纳米金溶液，4℃保存备用；（6）制备金标抗体：将步骤（5）所得的纳米金溶液用浓度0.01mol/L的碳酸钾溶液调节pH至6.5‑8.5；向其中加入步骤（4）所得多克隆IgG溶液，使IgG抗体浓度为20‑25μg/mL，摇匀后4℃静置30‑60分钟；然后加入牛血清白蛋白使其浓度为1%‑2%，搅拌反应1‑2小时，4℃静置2‑3小时；然后1500r/min离心20‑30分钟，弃去沉淀，再将上清液以20000r/min 4℃离心30‑60分钟，弃去上清液；将沉淀悬浮于10‑20mL浓度0.01mol/L、pH7.0‑7.4的磷酸缓冲液中，以20000r/min 4℃离心30‑60分钟，沉淀悬浮于5‑10mL浓度0.01mol/L、pH7.0‑7.4的磷酸缓冲液中，即为金标抗体溶液，4℃保存；（7）制备免疫纳米金试纸条：（a）:将步骤（6）所得金标抗体溶液用浓度0.01mol/L、pH7.0‑7.4的磷酸缓冲液稀释4‑6倍，所述磷酸缓冲液中含3%蔗糖、0.1%牛血清白蛋白和0.05% Tween‑20，按20µl/cm2的剂量喷涂在Glass 33型玻璃纤维素膜即结合释放垫上，然后37℃烘10‑20分钟；（b）:将所述捕获抗原用浓度0.01mol/L、pH9.0‑9.5的含3%甲醇的碳酸缓冲液稀释为8µg/ml，在AE99型硝酸纤维素膜的检测线位置喷涂1‑2µl；在此硝酸纤维素膜的质控线位置喷涂1000‑1500倍稀释的羊抗兔IgG抗体1‑2µl，检测线与质控线间距5‑8mm；将硝酸纤维素膜在37℃烘10‑20分钟；再将硝酸纤维素膜在20～25℃下浸泡在浓度0.01mol/L、pH7.0‑7.4的磷酸缓冲液中封闭10分钟，所述磷酸缓冲液中含0.5%BSA和0.05%叠氮钠，然后将硝酸纤维素膜在37℃烘10‑20分钟；（c）:依次将AE99硝酸纤维素膜、结合释放垫Glass 33玻璃纤维素膜、吸收垫Cotton linters 2668和样品垫Glass 33粘贴在PVC背板上；最后裁剪为4×50mm的试纸条。