[发明专利]易错PCR/卡那霉素筛选系统定向进化蛋白质内含子无效
| 申请号： | 201110053243.8 | 申请日： | 2011-03-04 |
| 公开（公告）号： | CN102206625A | 公开（公告）日： | 2011-10-05 |
| 发明（设计）人： | 李曼;孟清 | 申请（专利权）人： | 东华大学 |
| 主分类号： | C12N15/10 | 分类号： | C12N15/10;C12N15/65 |
| 代理公司： | 上海泰能知识产权代理事务所 31233 | 代理人： | 黄志达;谢文凯 |
| 地址： | 201620 上海市*** | 国省代码： | 上海;31 |
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| 摘要： | 本发明涉及一种易错PCR/卡那霉素筛选系统定向进化蛋白质内含子的方法，包括：1)制备大量用于定向进化的载体；2)对蛋白质内含子进行易错PCR，然后与上述用于定向进化的载体连接并灭活，再经过浓缩转化感受态细胞，涂含有氨苄霉素和卡那霉素的双抗平板；3)对在上述双抗平板上生长的菌落进行菌液PCR验证，并以初步鉴定为阳性克隆获得其混合质粒作为下一轮易错PCR的模板，进行多轮易错PCR，即得。本发明能较灵敏地筛选剪接活性提高的蛋白质内含子，通过调整PCR体系各成分的配比，扩增出来大量的DNA片段，该方法获得的蛋白质内含子剪接活性高。 | ||
| 搜索关键词： | 易错 pcr 卡那霉素 筛选 系统 定向 进化 蛋白质 内含 | ||
【主权项】：
一种易错PCR/卡那霉素筛选系统定向进化蛋白质内含子的方法，包括：1)利用一对引物5′端添加II型限制性内切酶Bsa I对载体pKH进行反向PCR，然后将反向PCR产物磷酸化，自连转化感受态，获得质粒pKH′，BsaI酶切后回收3516bp的片段，即获得用于定向进化的载体；2)利用一对引物5′端添加II型限制性内切酶Bsa I对蛋白质内含子进行易错PCR，然后与上述用于定向进化的载体连接并灭活，再经过浓缩转化感受态细胞，涂含有氨苄霉素和卡那霉素的双抗平板；其中易错PCR包括低、中、高浓度的Mg2+、Mn2+及dXTP，共12个反应，易错PCR中模板的量为50‑100ng；3)对在上述双抗平板上生长的菌落进行菌液PCR验证，并以初步鉴定为阳性克隆获得其混合质粒作为下一轮易错PCR的模板，进行4‑6轮易错PCR，获得一个的剪接活性最高的蛋白质内含子即为通过定向进化获得的一个进化后的蛋白质内含子。
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