[发明专利]一种开源方式筛选靶向结合人DYRK1A基因靶位点的锌指蛋白的方法

摘要

本发明一种开源方式筛选靶向结合人DYRK1A基因靶位点的锌指蛋白的方法，属于基因工程技术领域。该方法包括：(1)3个锌指蛋白库的构建；(2)报告载体和报告菌株的构建；(3)有效锌指库的筛选；(4)有效锌指库的连接、组装；(5)利用细菌双杂交原理筛选出具有较高特异性和亲和力的三锌指蛋白。本发明所述的方法具有获得的锌指蛋白特异性和亲和性较高，组装的锌指核酸酶有更高的效率的优点。

主权项

一种开源方式筛选靶向结合人DYRK1A基因靶位点的锌指蛋白的方法，包含下述步骤：(1)、3个锌指蛋白库的构建：分别以已知的由ZF1、ZF2和ZF3组成的三锌指序列为模板，构建3个锌指蛋白库，其中每个锌指蛋白库中保持三锌指序列中的两个锌指序列不变，只将其中一个锌指序列的α螺旋中编码7个氨基酸的21碱基完全随机化，得到该锌指域随机的锌指蛋白库ZFP1、ZFP2和ZFP3，其中ZFP1库中所有序列保持ZF2和ZF3不变，仅ZF1为随机序列；ZFP2库中所有序列保持ZF1和ZF3不变，仅ZF2为随机序列；ZFP3库中所有序列保持ZF1和ZF2不变，仅ZF3为随机序列；(2)、报告载体和报告菌株的构建：以阳性报告载体pBAC‑BA‑lacZ为底物，构建碱基序列片段，其中在该碱基序列片段中的原阳性报告载体相应位置上的三联碱基被作为引物的锌指序列识别的三联碱基代替；将所述碱基序列片段与阴性报告载体pBAC‑lacZ骨架连接，得到报告载体；把所得到的报告载体分别转化到感受态细胞KJBAC中，所得单克隆即为含有识别不同靶位点的报告菌株，所述报告菌株分别为pBAC‑RZFBS3‑lacZ、pBAC‑RZFBS2‑lacZ、pBAC‑RZFBS1‑lacZ、pBAC‑RZFBS‑lacZ、pBAC‑LZFBS1‑lacZ、pBAC‑LZFBS2‑lacZ、pBAC‑LZFBS3‑lacZ、pBAC‑LZFBS‑lacZ；(3)、有效锌指库的筛选：分别取步骤(1)中得到的锌指蛋白库和质粒pGal 4‑Kan同时电转化到步骤(2)所得的报告菌株中，筛选得到有效锌指库；(4)、有效锌指库的连接、组装：以步骤(3)筛选得到的同为一侧的有效锌指库为底物，用重叠PCR的方法将同侧的三个有效锌指库，分别扩增并连接起来，构建成识别整个右边靶位点的锌指蛋白库RF和左边靶位点的锌指蛋白库LF；(5)、利用细菌双杂交原理筛选出具有较高特异性和亲和力的三锌指蛋白：取步骤(4)中得到的锌指蛋白库RF和质粒pGal 4‑Kan共转化到步骤(2)所得的报告菌株pBAC‑RZFBS‑lacZ中，挑取深蓝色菌落，提取酶活较高菌落质粒，即为结合右半边靶位点的锌指蛋白；取步骤(4)中得到的锌指蛋白库LF和质粒pGal 4‑Kan共转化到步骤(2)所得的报告菌株pBAC‑LZFBS‑lacZ中，挑取深蓝色菌落，提取酶活较高菌落质粒，即为结合左半边靶位点的锌指蛋白。