[发明专利]用于实时PCR的核酸模板制备

摘要

本发明提出了用于高吞吐量实时PCR分析的来自细胞的核酸模板的有效制备的新的试剂配方。所述试剂允许快速的细胞裂解和模板制备，而不需要模板纯化和分离。因此，所述试剂显著地提高了实时PCR分析的吞吐量，同时在PCR扩增的少至约35个循环内允许单分子核酸模板的快速的且灵敏的实时Catacleave PCR检测。

主权项

一种制备用于实时PCR扩增的核酸模板的方法，所述方法包括以下步骤：在裂解试剂中裂解细胞，所述裂解试剂包括pH为大约6至大约9的缓冲液、浓度为大约0.125％至大约2％的两性离子洗涤剂、浓度为大约0.3mg/ml至大约2.5mg/ml的叠氮化物以及蛋白酶，使所产生的细胞裂解物在大约55℃孵育大约15分钟，以产生基本上无蛋白质的细胞裂解物，使所述蛋白酶在大约95℃失活大约10分钟，将所述无蛋白质的细胞裂解物直接加入到实时PCR扩增反应混合物中，所述实时PCR扩增反应混合物包括：一对扩增引物，能够退火以在所述细胞裂解物中获得目标DNA；包括能够检测的标记的探针以及与所述目标DNA的区域基本上互补的DNA和RNA核酸序列；扩增聚合酶活性；扩增缓冲液；RNase H活性，其中，在所述目标DNA在第一扩增引物和第二扩增引物之间扩增之后，所述探针内的RNA序列能够与所述目标DNA中的互补的DNA序列形成RNA:DNA异源双链体。