[发明专利]一种高效制备CIK细胞的方法

摘要

本发明涉及生物技术领域，具体地说是一种高效制备CIK细胞的方法，其特征在于采用如下制备步骤：初步分离淋巴细胞；采用洗液两次洗涤；调节淋巴细胞浓度；培养：将调节好浓度的淋巴细胞加入已包被CD3抗体的细胞瓶内培养24小时，再加入IFN-γ试剂1ml，IL－1β试剂1ml培养48小时得CIK细胞；扩大培养；收集。本发明同现有技术相比，采用先包被CD3抗体，后加入INF-γ，并打破常规使用IL-1β，通过包被使得细胞更持久的接触抗体，用量少激活效果更好；本发明制备的CIK细胞，细胞毒活性明显高于现有CIK细胞30%以上，解决了CIK细胞繁殖能力差、细胞活性低的问题，并大大降低了成本。

主权项

一种高效制备CIK细胞的方法，其特征在于采用如下制备步骤：（1）初步分离淋巴细胞：取人浓缩白细胞，用人淋巴细胞分离液分离淋巴细胞以2000rpm，离心20分钟，然后先吸出上层血浆，灭活备用，再吸取下层富含淋巴细胞的白环层；（2）两次洗涤：在吸取的富含淋巴细胞的溶液中加入洗液，再以1500rpm离心10分钟，弃上清，取沉淀的细胞，完成第一次洗涤；再在获取的沉淀的细胞中加入洗液，以1500rpm离心10分钟，弃上清，取沉淀的细胞，即淋巴细胞，从而完成对淋巴细胞的两次洗涤，并计数；（3）调节淋巴细胞浓度：用基本培养基调节淋巴细胞浓度至2～3×106个/ml；（4）培养：将调节好浓度的淋巴细胞加入已包被CD3抗体的细胞瓶内培养24小时，再加入IFN‑γ试剂1ml，IL－1β试剂1ml培养48小时得CIK细胞；（5）扩大培养：将生长活力为100％的CIK细胞转入175cm2细胞培养瓶内，用CIK培养基进行扩大培养，每48～72小时扩大培养一次，至15‑20天；（6）收集：将细胞活力大于98％的CIK细胞收集汇总，然后进行如下洗涤：将收集汇总的CIK细胞以1500rpm离心10分钟，弃上清取底部沉淀细胞；再在获取沉淀细胞中加入洗液重复上述洗涤2～3次，获得的沉淀细胞用200目过滤器过滤，取过滤下来CIK细胞，计数CIK细胞总数及细胞活力；（7）将CIK细胞悬浮于100ml　0.9%的生理盐水中，加入2×105单位的IL－2和10ml的白蛋白，混合均匀后，封口得最终成品。