[发明专利]一种从油/气藏环境中提取微生物宏基因组的方法

摘要

本发明提供一种由油/气藏复杂环境样品中直接提取微生物宏基因组的简易方法，包括以有机相/水相萃取获得油样/油水样中微生物组份，真空过滤水相富集微生物，以溶菌酶、蛋白酶、十二烷基硫酸钠(SDS)等裂解细胞，在高盐条件下通过十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)去除蛋白质以及多糖等有机大分子组份，随后通过核酸抽提及沉淀，获得无偏好的油/气藏微生物宏基因组成分。本发明所述方法快捷简单，成本低廉，整个提取过程可在10小时之内完成；所获基因组纯度高，OD260nm:OD280nm比值在1.7-2.0之间，电泳结果检测基因组整体无降解情况。本发明方法不仅针对油/气藏复杂环境，还适用于其他受石油污染的土壤及水体中微生物基因组的提取。

主权项

一种从油/气藏环境中提取微生物宏基因组的方法，其特征在于:包括步骤：（1）有机相/水相萃取获得液相样品中微生物组份；具体的说，在液相样品中加入与样品等体积的10‑50%（V/V）的乙醇和样品半数体积的石油醚/正己烷混合物，石油醚/正己烷（V/V）= 1‑3：1，充分摇匀；静止使油水相分层，用胶管抽取下层水相；用滤纸过滤掉水相中原油和其他杂质；（2）将步骤1）所获水相经0.22µm微孔滤膜真空抽滤，富集菌体于滤膜上；（3）对步骤2）所得微生物细胞进行裂解，具体的说，将滤膜剪碎放入10mL离心管中，加入100‑500µL溶菌酶溶液，溶菌酶浓度是溶菌酶5‑20mg/mL溶于10mM Tris‑HCl, pH8.0，37℃水浴0.5‑2h；加入50‑300µL 10%（W/V）的SDS和10‑50µL浓度20mg/mL蛋白酶K，37℃水浴1‑4h；（4）高盐条件下通过CTAB去除步骤3）所获组份中的蛋白质和有机大分子（如多糖）；具体的说，向步骤（3）终溶液中加入100‑500µL的5M NaCl颠倒混匀，加入100‑500µL 5% CTAB（十六烷基三甲基溴化铵），50‑80℃水浴10‑60min；（5）对步骤4）所获组分进行核酸抽提及沉淀；具体的说，冷却至室温后吸出上清，碎膜用100‑500µL无菌去离子水洗涤一次，吸出上清，将两次吸出的上清液体混合，加入等体积的氯仿：异戊醇=24：1的混合物，颠倒混匀0.5‑5min，静置1‑5min；12000rpm离心10‑3min，吸出上清；加入0.5‑1倍体积的异丙醇，‑20℃放置3h或放置过夜；12000rpm离心10‑30min，倒掉上清，沉淀加入1‑5mL冷75%乙醇洗涤一次，凉至乙醇挥发殆尽，加入10‑100µL无菌去离子水溶解所获宏基因组成份。