[发明专利]一种甘蔗黑穗病抗性鉴定方法

摘要

本发明涉及植物抗病性鉴定技术领域，提出一种甘蔗黑穗病抗性鉴定方法，首先用微量新鲜甘蔗黑粉菌冬孢子分离培养出甘蔗黑粉菌异型交配型（+、-）单倍体担孢子，然后经过菌株扩大培养、接种、发病率调查、抗性评价等步骤，本发明具有以下突出的实质性特点和显著的进步：1、只需极少量甘蔗黑粉菌冬孢子经分离培养，即可满足接种需要，工作量小；2、异型交配型菌株能够超低温保存，经活化、扩大培养后可作接种源，无需每次鉴定都重新采取菌种并分离培养；3、本发明抗性鉴定历期短、灵敏性高；4、还可利用本发明的方法，鉴别出参试品种所抗感的黑穗病生理小种类型，有效指导甘蔗抗黑穗病育种及蔗区品种合理配置。

主权项

一种甘蔗黑穗病抗性鉴定方法，其特征在于包括以下步骤：步骤A、甘蔗黑粉菌异型交配型（+、‑）单倍体担孢子的分离培养A1．在无菌条件下，取3～10ug新鲜甘蔗黑粉菌冬孢子，用YEPS液体培养基充分稀释成50～100个甘蔗黑粉菌冬孢子/mL的稀释液；A2．吸取100～200uL稀释液均匀涂板于YEPS固体培养基上，于28～30℃下培养2～3天，得到白色“羊毛状”单菌落；A3. 挑取1个白色“羊毛状”单菌落，用YEPS液体培养基充分稀释成50～100个担孢子/mL的稀释液，然后吸取100～200uL稀释液均匀涂板于YEPS固体培养基上，于28～30℃下培养2～3天，得到“酵母状”单菌落；A4. 挑取10～15个“酵母状”单菌量菌液落分别于400～500uL 的YEPS液体培养基中混匀，然后于28～30℃下振荡培养1～2天；得到OD600值为1.0‑1.5的菌液；A5. 将A4得到的各个菌液分别吸取1～2uL在YEPS固体培养基上一对一随机配合,于28～30℃下培养2～3天，得到 “酵母状” 菌落和“羊毛状”菌落，“酵母状” 菌落为同型（+、+/‑、‑）交配型单倍体担孢子所形成，“羊毛状”菌落为异型交配型（+、‑）单倍体担孢子形成；由此确定A4中至少一对异型交配型菌液；步骤B、菌株扩大培养取步骤A4中的一对异型交配型单倍体担孢子菌液，分别用YEPS液体培养基3～5mL于28～30℃扩大培养1～2天，得到OD600值达1.0‑1.2的2份菌液；步骤C、接种将步骤B培养得到的2份菌液等体积混匀；随后用注射器吸取20～30uL混合菌液，注射入事先种植好的甘蔗小苗生长点，接种甘蔗小苗20～30株/品种；步骤D、发病率调查将步骤C接种的甘蔗小苗置于25～30℃下生长，自出现第1株甘蔗发生黑穗病起，定期调查、记录甘蔗黑穗病发生株数，并将记录过的黑穗病发病株连根挖除，调查历期2～3个月，并计算每个参试品种的黑穗病株发生率；步骤E、抗性评价    根据黑穗病抗性分级标准及参试品种的黑穗病株发生率，评价参试品种的黑穗病抗性水平。