[发明专利]一种羊水源性神经干细胞的分离培养方法

摘要

本发明公开了一种羊水源性神经干细胞的分离培养方法，首先分离到羊水细胞，然后再在羊水细胞中添加分离培养基，分离得到的神经干细胞生长形成神经球，将其消化分离为单细胞后进行传代培养。本发明提供的羊水源性神经干细胞的分离培养方法，开辟了分离培养神经干细胞的新途径，应用本发明方法从羊水中分离培养神经干细胞成功率高。所分离到的羊水源性神经干细胞在体外诱导后分化为星形胶质细胞和神经元细胞等功能细胞；所分离到的羊水源性神经干细胞具有可行性和有效性，具有自我更新、增殖和分化潜能。

主权项

一种羊水源性神经干细胞的分离培养方法，其特征在于，包括以下步骤：1)将无菌的胎儿羊水用细胞筛网过滤，分别收集滤液和沉淀，将滤液离心后收集上清，获得羊水上清液，将羊水上清液与羊水细胞培养液按照1∶0.5～2的体积比混合后，得到混合培养液；用混合培养液将沉淀物重悬，制成细胞悬浮液，并接种于贴壁细胞培养瓶中，在37℃、5％CO2培养箱中培养，每隔4天换液；当培养瓶铺满单层细胞时，吸弃培养液，加入细胞分离无酶缓冲液，待全部细胞脱壁后，分散细胞，收集细胞悬液后离心去除上清，收集细胞得到羊水细胞；所述的羊水细胞培养液是以MEMα‑medium为基础培养基，还包括以下组分：体积分数10～20％的胎牛血清、质量分数1～2％的L‑谷氨酰胺、100～200IU/mL青霉素、100～200μg/mL链霉素和质量分数2～5％的Chang Medium；2)用羊水源性神经干细胞培养液稀释羊水细胞制成细胞悬浮液，将细胞悬浮液接种于培养板，在37℃、5％CO2培养箱中培养；待羊水细胞中的神经干细胞生长形成神经球悬浮于培养液时，吸取神经球转移至培养板中，加入神经球消化液消化成絮状物，再将絮状物转移至羊水源性神经干细胞培养液中，用吸管吹吸絮状物，使其分散为单个细胞形成细胞悬液，然后接种于包含有羊水源性神经干细胞培养液的培养板中，在37℃、5％CO2和饱和湿度下培养，每2d在培养液中添加终浓度为0.1～1ng/L的EGF和终浓度为0.01～0.1ng/L的bFGF；5d以后吸取形成的神经球，将神经球用神经球消化液消化分离后，得到羊水源性神经干细胞；所述的50mL羊水源性神经干细胞培养液包含1～2mL B27培养液、0.5～2mL N2培养液、5～10×10‑3ng的表皮生长因子、5～10×10‑4ng的碱性成纤维细胞生长因子、50～100IU的青霉素、50～100μg的链霉素和50～100μg的L‑谷氨酰胺，其余为Neurobasal medium；所述的20mL消化液包含1.5～3mmol Na2SO4、0.6～1mmol K2SO4、0.1～0.5mmol MgCl2、0.005～0.01mmol CaCl2、0.02～0.05mmol N‑(2‑羟乙基)哌嗪‑N′‑2‑乙磺酸，0.4～1.0mmol葡萄糖、0.0025～0.005mmol NaOH、6.0～8.0mg半胱氨酸和200～300μg木瓜蛋白酶，其余为水。