[发明专利]多种支原体单克隆抗体的制备方法及多联免疫检测试剂

摘要

本发明涉及多种支原体单克隆抗体的制备方法及多联免疫检测试剂，其特征在于，将肺炎支原体、人型支原体、溶脲脲原体分别免疫小鼠，进行细胞融合和克隆化，制备出特异性强且效价高的三种单克隆抗体。将以上单克隆抗体以一定比例混合制备成支原体多联免疫检测试剂，用以检测以上几种支原体感染性疾病，该试剂能快捷准确的检出支原体病，取样避免抽血不给病人带来痛苦。为患者得到及时、有效治疗提供保证。该试剂制备和使用过程不产生有害的废气、废水，也不会给患者及操作者带来任何损害，是一种环保、安全、准确、灵敏的生物制剂。

主权项

多种支原体单克隆抗体的制备方法，其特征在于，包括下述步骤：(1)将肺炎支原体、人型支原体及溶脲脲原体的三种标准菌株分别扩增培养后，得三种支原体免疫原菌液：肺炎支原体原菌液、人型支原体原菌液、溶脲脲原体原菌液；(2)每种原菌液浓度调到105/ml，在50℃±5℃恒温箱中灭活，并与等量完全佐剂混合，以每只0.2ml的量，腹腔注射免疫小鼠，于第一次免疫后第7、14、28天分别追加免疫一次；(3)第31天取免疫小鼠脾细胞制成脾细胞悬液，浓度调到1×108/ml；再取sp20小鼠骨髓瘤细胞，制成骨髓瘤细胞悬液，浓度调到2～3×107/ml，将以上两种细胞悬液混合进行细胞融合；(4)然后将经过细胞融合的细胞悬液加到辅有饲养细胞的96孔培养板中，每孔0.1ml，将培养板置37℃±1℃，含体积浓度5％CO2的孵箱中培养，用酶联免疫反应法检测阳性孔，将确定为阳性的孔的杂交瘤细胞以有限稀释法进行克隆化；(5)用无血清培养液加入到克隆化后的阳性杂交瘤细胞中进行扩增培养，浓度调整为1×106/ml，以每只0.5ml的量腹腔注射接种到Balb/C小鼠，接种后7～14天，处死小鼠，收取腹水、离心、取上清即为该种支原体的腹水型单克隆抗体；(6)采用酶联免疫反应法，分别对肺炎支原体、人型支原体及溶脲脲原体腹水型单克隆抗体进行效价、亚型及交叉试验，筛选出效价为1×10‑5～1×10‑7、特异性强的肺炎支原体单克隆抗体、人型支原体单克隆抗体和溶脲脲原体单克隆抗体，其中，所述的特异性强是指除自身支原体外不与其它支原体发生交叉反应。