[发明专利]一种分离原代成人肝细胞的方法及其专用无菌器械盒

摘要

本发明公开一种分离原代成人肝细胞的方法，其包括以下步骤：(1)对已去除结缔组织的离体成人肝组织用针头注射器在组织表面进行多点穿刺，注射前灌流液；(2)用针头注射器在组织表面再次进行多点穿刺注射IV型胶原酶溶液；(3)分离肝组织加入IV型胶原酶溶液在37℃温度下震荡消化得到消化物；(4)消化物经过滤后、用红细胞裂解液处理，然后离心、收集底层沉淀，再用肝细胞洗涤缓冲液重悬肝细胞，再次过滤、离心处理后弃上清液，收集底层沉淀物；(5)对步骤(4)中得到的底层沉淀物用无血清DMEM培养基洗涤后得到原代成人肝细胞。本发明还公开了上述分离原代成人肝细胞的方法专用的一次性无菌器械盒。本发明利用一次性专用器械盒通过肝组织表面多点穿刺注射分离成人肝细胞，简化了操作，降低了成本，适合从肝切除回收的不规则小块离体成人肝组织中提取肝细胞。

主权项

一种分离原代成人肝细胞的方法，其特征在于，其包括以下步骤：(1)对已去除结缔组织的离体成人肝组织用针头注射器在组织表面进行多点穿刺，注射前灌流液，直至整块肝组织由暗红色变为灰白色，且流出的前灌流液变清亮；(2)另取针头注射器在肝组织表面再次进行多点穿刺注射IV型胶原酶溶液，直至整块肝组织块变疏松、失去弹性，表面呈龟背状裂隙；(3)分离肝组织，去除残存的包膜和纤维结缔组织，放入无菌瓶中，加入IV型胶原酶溶液在37℃温度下震荡消化得到消化物；(4)将消化物吹打成为细胞悬液，在冰浴条件下过滤，收集过滤后的肝细胞悬液，移至离心管中，离心处理后去上清液，底层沉淀加入红细胞裂解液，室温静置2～3分钟后，再进行离心，收集底层沉淀，用肝细胞洗涤缓冲液重悬肝细胞，再次过滤、离心处理后弃上清液，收集底层沉淀物；(5)对步骤(4)中得到的底层沉淀物用无血清DMEM培养基洗涤后得到原代人肝细胞。