[发明专利]一种利用LAMP快速检测中国番木瓜曲叶病毒的方法

摘要

本发明提供了一种快速检测中国番木瓜曲叶病毒的方法，属植物保护领域。根据中国番木瓜曲叶病毒核苷酸序列设计LAMP引物(P_F3，P_B3，P_FIP，P_BIP)。样品提取总DNA后，进行LAMP反应，反应产物经电泳或者荧光染料的方法实现中国番木瓜曲叶病毒的检测。该方法操作简单，无需PCR仪等特殊仪器，同时又克服克服了传统的生物学、血清学等方法上存在的问题，是一种简捷、快速、灵敏而经济的检测方法。

主权项

一种利用LAMP快速检测中国番木瓜曲叶病毒的方法，包括以下步骤：(1)引物设计：根据NCBI上已报道的中国番木瓜曲叶病毒核酸序列设计引物，引物序列如下：P‑F3：5`‑CAAACTTCCCTATGCAATCG‑3`P‑B3：5`‑GATTTGAATTAAATAGGCTTTGAGG‑3`P‑FI P：5`‑GCCGCTTTTGGATTTTGAATTTTGA‑ATGGGTCCTTATTTATATGTGAG‑3`P‑BI P：5`‑TCCGTATAATATTACCGGATGGCC‑GTTTTAAATGGAGGACATTTCTTTG‑3`(2)总DNA提取：取10mg番茄病叶于1.5mL离心管，加100μL 0.5mol/L NaOH，匀浆后5000rpm离心5min，上清液用0.1mol/L Tris‑HCl(pH8.0)稀释100倍，取1μL作为模板进行PCR扩增。(3)LAMP反应：反应体系：总体系为25μL，其中DNA 2μL，Bst DNA聚合酶(8U/μL)1μL，其它组分终浓度分别为P‑F3和P‑B30.2μmol/L；P‑FIP和P‑BIP 1.6μmol/L；Betaine 0.8mol/L；dNTPs 1.4mmol/L，1倍的Thermopolbuffer(含MgSO42mmol/L)；MgCl28mmol/L。反应条件：65℃恒温水浴锅60min；80℃5min。(4)检测：电泳检测：取10μL产物经1％琼脂糖凝胶在0.5×TBE缓冲液和120V电压条件下电泳40min，在0.5μg/mL的溴化乙锭(EB)中染色10min，染色后于凝胶成像系统中观察，在感染中国番木瓜曲叶病毒的样品中可以观察到明亮的呈弥散状的核酸泳带。荧光染料：LAMP反应结束后，向其产物中加入SYBR GreenI(1∶1000)2μl，1‑5min后察结果，感染中国番木瓜曲叶病毒的样品变成绿色，而未感染样品及空白对照保持染料的橙色。