[发明专利]一种利用SSR法对两系杂交水稻种子进行纯度检验的方法

摘要

本发明公开了一种利用SSR法对两系杂交水稻种子进行纯度检验的方法，特别是一种利用SSR分子标记对丰两优一号或者丰两优香一号种子进行纯度检验的方法。其利用引物P1和P2分别对两系杂交水稻品种丰两优一号及其父母本，或者丰两优香一号及其父母本的基因组DNA进行扩增和琼脂糖电泳分离，找出杂交一代与父母本差异的特征谱带，通过受检种子纯度计算，对丰两优一号或丰两优香一号样品进行检验，其检验的纯度经与田间种植鉴定的纯度对照比较，二者的结果高度一致。适用于对丰两优一号或丰两优香一号两系杂交水稻及其亲本真实性和品种纯度的检验。

主权项

一种利用SSR法对丰两优或丰两优香一号两系杂交稻种子进行纯度检验的方法，其特征在于其具体步骤是：1)样品DNA提取：将种子浸种24小时后，取发芽4‑5天后的幼芽，剪取1cm左右的幼芽，放入PCR管中，并加入NaOH溶液，沸水中煮45sec后加入Tris‑HCI(pH 3)，煮沸2min后置冰上冷却，4℃下保存备用；2)PCR扩增：在PCR反应板内加入样品DNA提取液、buffer、dNTP、引物、ddH2O和Taq酶；先进行94℃下的预变性4min；接着进行35个循环反应，即94℃下变性15sec，55℃复性15sec，72℃下延伸30sec；最后在72℃下延伸7min；反应完成后，加入buffer终止反应，置4℃环境下保存备用；3)琼脂糖凝胶电泳：制胶：在200ml浓度为3％的琼脂糖溶液中加入0.5μg/ml的EB后，倒入专用琼脂糖制胶模板内，插好梳子；点样：待琼脂糖溶液完全凝固后，拆除模板和梳子，将凝胶放入具有1×TBE电泳液的电泳槽中，使电泳液液面高出凝胶1cm左右；将步骤2)中的PCR扩增产物，对应加入琼脂糖凝胶的点样孔内；电泳：设定电压200V，将电泳槽与电泳仪的电极连接通电，直至溴酚蓝指示剂迁移至可以使扩增DNA片段能够被清楚识别的距离时，关闭电源，停止电泳；4)利用凝胶成像系统拍照记录样品DNA片段的特征谱带；5)受检种子纯度计算：用上述方法获取丰两优一号及其父母本电泳谱带或丰两优香一号及其父母本电泳谱带，以杂交种的父母本特征谱带作为对照，找出杂交种与父母本差异的特征谱带，进行一致性分析和评价，并根据杂交种的一致性分析结果，采用下式计算受检样品的种子纯度：受检样品的种子纯度(％)＝(供检样品幼苗株数‑非本品种幼苗株数)/供检样品幼苗株数×100。