[发明专利]一种从黄单胞菌中提取α-葡萄糖基化丁香酚合成酶的方法

摘要

一种从黄单胞菌中提取α-葡萄糖基化丁香酚合成酶的方法，属于生物制品分离纯化领域。工艺流程为：细胞培养→超声破碎→硫酸铵沉淀→透析→DEAE-离子交换层析→Sephadex G75凝胶层析→冷冻干燥，使用该方法提取的纯酶酶活最高可达127.1U/mg，收率为11.1％。本发明操作简单，所用仪器少，可快速实现α-EG合成酶的分离纯化。

主权项

一种从黄单胞菌中提取α‑葡萄糖基化丁香酚合成酶的方法，其特征包括以下步骤：(1)粗酶液的获得将培养一定时间的黄单胞菌发酵液离心，弃上清，沉淀即为菌体细胞。细胞沉淀用适量缓冲液回溶，在冰浴中破碎30min(5s/5s，300w)，而后8000r/min离心15min，上清液即为粗酶液。(2)硫酸铵沉淀在粗酶液中缓慢加入固体硫酸铵粉末至30％(w/v)饱和度，期间不断搅拌，4℃下静置4‑24h，12000r/min离心15min，弃沉淀；上清液加硫酸铵至45％(w/v)饱和度，4℃下静置4‑24h，12000r/min离心15min，弃上清液，沉淀即为所需酶液。(3)透析除盐将酶沉淀用适量的缓冲液溶解，并在相同缓冲液中透析，期间不断更换缓冲液，直到检测不出SO42‑为止。8000r/min离心5min，弃沉淀。(4)DEAE‑纤维素离子交换层析待酶液全部进入离子交换纤维素后，用3倍柱体积的缓冲液(pH7.0)洗脱至A280不变。然后分别用含有0‑1.0mol/LNaCl的缓冲液(pH7.0)进行梯度洗脱，流速为1.5mL/min，收集具有酶活部分。(5)Sephadex G‑75凝胶层析将收集到的有活性的酶液用超滤离心管(截留分子量10KDa)浓缩至2mL左右，加入经缓冲液平衡后的葡聚糖凝胶Sephadex G‑75层析柱进行层析。待样品完全进入凝胶后，以流速为0.5mL/min进行洗脱，收集具有酶活性的部分，即得电泳纯α‑EG合成酶。所述步骤(2)中硫酸铵第一次添加浓度为30％(w/v)饱和度，第二次添加浓度为45％(w/v)饱和度。步骤(4)中所述NaCl浓度梯度洗脱采用0.1mol/L、0.2mol/L、0.3mol/L、0.4mol/L、0.5mol/L和1.0mol/L浓度的NaCl缓冲液。