[发明专利]用石蒜鳞茎提取并纯化石蒜凝集素的方法及其生产的石蒜凝集素

摘要

本发明公开了一种用石蒜鳞茎提取并纯化石蒜凝集素的方法及其生产的石蒜凝集素，是以石蒜鳞茎为原料，经特定的工艺提取并纯化而得到的一种单一蛋白带的石蒜凝集素纯品，表观分子量48KD，是由四个分子量相同的亚基组成的蛋白质，一种无定形粉末，石蒜凝集素含量高达90％，其工艺步骤依次为：(1)原料制备、(2)打浆、(3)第一次离心分离、(4)浸提、(5)第二次离心分离、(6)合并离心分离液1和2、(7)分级沉淀、(8)第三次离心分离、(9)第一次透析除盐、(10)电泳色谱分离、(11)分子筛层析、(12)洗脱、(13)第二次透析除盐、(14)真空浓缩、(15)真空干燥。本发明方法提供了一种既可以提取石蒜凝集素又可以提取石蒜多糖、石蒜胶、还可以提取分离石蒜总生物碱的方法，工艺简单，节能降耗。

主权项

一种用石蒜鳞茎提取并纯化石蒜凝集素的方法，是以石蒜属植物鳞茎为原料，经提取纯化而得到的石蒜凝集素，其工艺步骤依次为：(1)原料制备、(2)打浆、(3)第一次离心分离、(4)浸提、(5)第二次离心分离、(6)合并离心分离液1和2、(7)分级沉淀、(8)第三次离心分离、(9)第一次透析除盐、(11)分子筛层析、(12)洗脱，其特征在于增加步骤(10)电泳色谱分离，(13)第二次透析除盐，(14)真空浓缩，(15)真空干燥，与工艺步骤相应的工艺条件和具体操作为：(1).原料制备：将新鲜石蒜鳞茎去根、除杂、清洗干净、去黑皮，切片得新鲜原料，亦可用鳞茎干粉或干片为制取石蒜凝集素的干原料；(2).打浆：将新鲜原料片经粉碎机粉碎打浆得浆状原料；(3).第一次离心分离：浆状原料用离心机经3500转/分离心分离，得离心分离液1和离心固相1；(4).酶解浸提：离心固相1加入4倍离心固相重的生理盐水分两次浸提，生理盐水中含植物复合酶0.05ml/l，植物复合酶的浓度为105000u/ml，浸提时间为4‑5小时，浸提温度为常温；(5).第二次离心分离：浸提完成后都用离心机在3500转/分离心分离，得离心分离液2和离心固相2，离心固相2用于生产乙醇；(6).合并离心分离液1和离心分离液2；(7).分级沉淀：在合并后的离心液中逐步加入饱和硫酸铵溶液，收集加入饱和硫酸铵溶液的量为离心液0.43倍重至2.4倍重的沉淀，即当饱和硫酸铵溶液加入量为离心液0.43倍重前和饱和硫酸铵溶液加入量为离心液2.4倍重后的沉淀皆不取；(8).第三次离心分离，收集加入饱和硫酸铵溶液的量为离心液0.43倍重至2.4倍重的沉淀经管式离心机在转速为3500转/分离心分离得离心液3和离心固相3；离心液3用以生产石蒜多糖、石蒜胶、石蒜生物总碱，保留离心固相3；(9).第一次透析除盐：将离心固相3放在透析袋中用纯净水透析除去硫酸铵盐，用氯化钡溶液至检不出硫酸根离子为终点，得石蒜凝集素粗品，透析袋截留分子量≥10KD，10KD＝10000D(道尔顿)(10).电泳色谱分离：将石蒜凝集素粗品溶于用0.02mol/L的NaAC‑HAC，pH4.5的吸附缓冲液中备用；首先用泵将吸附缓冲液连续输入电极室、冲洗室、和进样室，然后开启电泳仪电源，当篮胶亲和介质与吸附缓冲液达到平衡后，将含有石蒜凝集素粗品的缓冲液用泵输入进样室，开始电泳吸附.电泳吸附过程持续约60分钟之后进行15分钟的电泳淋洗，关闭电源，将吸附缓冲液换成洗脱缓冲液，再打开电泳电源，进行电泳洗脱，收集活性部分经浓缩得石蒜凝集素浓缩样品，吸附缓冲液：20mM NaAC‑HAC，pH4.5，电流强度I＝60Ma，洗脱缓冲液：20mM Tris‑HCl，pH 8.5；洗脱缓冲液，流强度I＝40Ma，(11).分子筛层析：将石蒜凝集素浓缩样品注入层析柱中，层析柱的填料是Sephacryl S‑200分子筛，平衡Sephacryl S‑200分子筛层析柱用的是灭菌生理盐水；(12).洗脱：洗脱时用的洗脱液是灭菌生理盐水，流速是1.0‑1.5ml/min，收集活性部分，活性的检测方法是处理好的鲜兔血红细胞检测其活性.(13).第二次透析除盐：将活性部分放在透析袋中用纯净水透析除盐，用硝酸银溶液检测至检不出氯离子为终点，得石蒜凝集素精品溶液透析袋截留分子量≥10KD，10KD＝10000D(道尔顿)(14).真空浓缩：将得到石蒜凝集素精品溶液采用真空浓缩，真空度为‑0.085MPa，浓缩温度为35‑40℃得浓缩样品(15).真空干燥：将得到的浓缩样品采用真空干燥，真空度为‑0.085MPa，干燥温度为常温，得不定形粉末。