[发明专利]环孢霉素A免疫原、特异性抗体、检测试剂及检测试剂盒

摘要

本发明公开了环孢霉素A免疫原，以及由此得到的环孢霉素A特异性抗体、检测试剂及检测试剂盒。本发明使用特异的环孢霉素A衍生物，采用化学合成的方法制备出环孢霉素A酶标偶联物，环孢霉素A免疫原，以及由此免疫原制备的环孢霉素A特异性抗体，并由以上各种物质制备出一种环孢霉素A均相酶免疫检测试剂。本发明中的检测试剂灵敏度高、特异性强且可借助全自动生化分析仪实现环孢霉素A的高通量、快速化和自动化检测。

主权项

环孢霉素A免疫原，其结构式如式（I）所示：式中，R为连接基团，载体具有免疫原性，R为–O‑(CH2)4‑COO‑，载体为牛血清白蛋白，其制备方法包括如下步骤：化合物1的合成准确称取1.0 g 4‑戊烯酸和1.6 g N‑羟基琥珀酰亚胺加入到含有40 mL 四氢呋喃的干燥100 mL圆底烧瓶中，并置于磁力搅拌器上搅拌；准确称取2.5 g 1,3‑二环己基碳二亚胺，加入到20 mL 四氢呋喃中，置于磁力搅拌器中充分混匀；在23℃下，将步骤2中的混合物逐滴加入到步骤1的混合物中，并不断搅拌，所有的固体颗粒快速溶解，并迅速产生一种白色沉淀；将混合物搅拌过夜，过滤，真空浓缩并使用硅胶快速色谱纯化柱纯化，洗脱液：石油醚/乙酸乙酯=1/1，得到1.5 g白色固体化合物1；化合物2的合成准确称取如下化合物：400 mg环孢霉素A，600 mg化合物1和56 mg的1,3‑二异亚丙基丙酮‑4,5‑二氢咪唑‑2‑甲叉基‑环己基膦‑苯亚甲基二氯钌，将其溶解于10 ml CH2Cl2中；将上述混合溶液加入到100 ml 经火焰干燥的Schlenk 管中，经剧烈搅拌并回流冷凝22小时完成反应，冷却后，该混合液经真空浓缩后得到一种固体粗提物，将该粗提物经快速色谱纯化，洗脱液：15%乙腈‑乙酸乙酯，得到400 mg 黄色化合物2；环孢霉素A衍生物的合成称取1 g 化合物2，和166 mg 氢氧化锂LiOH·H2O，将其溶解于5 ml 蒸馏水和20 ml 四氢呋喃中，室温下搅拌过夜；将该化合物经负压浓缩并用水稀释，用1N 盐酸精确调节该溶液pH至5，并用乙酸乙酯萃取；萃取分层后，将有机层分离并经Na2SO4吸水干燥，经过滤、真空浓缩和高效液相色谱纯化后获得环孢霉素A衍生物白色固体；BSA‑环孢霉素A免疫原的合成环孢霉素A免疫原由牛血清白蛋白与环孢霉素A衍生物通过‑O‑(CH2)4‑COO‑基团连接而成，具体的合成方法如下：将200 mg BSA溶解于50 ml 0.2 M，pH 8.5的磷酸缓冲液中；将如下化学品加入到小烧杯中搅拌溶解：200 mg环孢霉素A衍生物、3.5 ml 二甲基酰胺、3.5 ml 乙醇、7.0 ml 10 mM， pH 5.0 的磷酸钾缓冲液、400 mg 1‑乙基‑3‑(‑3‑二甲氨丙基)碳二亚胺、50 mg N‑羟基硫代琥珀酰亚胺，于室温下搅拌溶解反应30分钟；将溶解好的溶液滴加至BSA溶液中，并在2～8℃下搅拌过夜，得到抗原；将合成好的抗原经过中性磷酸盐缓冲液透析4×4L纯化，得到环孢霉素A免疫原。