[发明专利]利用锌指核酶技术培育斑马鱼的方法及其在建立药物筛选模型中的应用

摘要

利用锌指核酶技术培育斑马鱼的方法及其在建立药物筛选模型中的应用，本发明使用这一技术构建了DNA修复酶Ogg1基因突变的斑马鱼转基因系，并以此为基础建立了脑保护药筛选的动物模型。本发明首先确定了Ogg1基因特异性锌指结合位点以及锌指蛋白序列，以组装的三联体锌指蛋白表达载体为模板，体外转录锌指蛋白编码RNA，并导入斑马鱼受精卵诱变。筛选得到的阳性Ogg1突变系鱼具有明显的神经元DNA易损性，可致脑部特异性缺陷。本发明同时提供将该脑神经元易损性的模型用于脑保护药物的方法。利用本发明的新模型及方法，为脑保护药物的筛选提供了经济快捷的新途径，有助于开发治疗脑损伤的药物。

主权项

利用锌指核酶技术培育斑马鱼的方法，其特征在于制备步骤为：a.Ogg1特异性锌指结合序列的确定：选择Ogg1基因的第2外显子SEQ ID NO.1以确定锌指特异性结合位点，所述特异性位点序列如SEQ ID NO.2～5所示；b.设计构建三锌指结合域，连接装配成三联体：其中F1作为氨基端的锌指，F2作为中间锌指，F3作为羧基末端的锌指；通过Addgene的Zinc Finger Consortium Modular Assembly Kit 1.0确定Ogg1特异性结合位点对应的锌指蛋白单元质粒pc3XB‑F1、pc3XB‑F2、pc3XB‑F3，并通过连接反应构建锌指三联体pc3XB‑F1/2/3；c.构建锌指蛋白表达质粒：从上面构建的质粒中使用PCR技术扩增编码锌指序列的DNA片段，引物如SEQ ID NO.6～7所示；使用XbaI和BamHI双酶切PCR产物及Addgene公司的锌指表达质粒pMLM290 和 pMLM292，通过T4 DNA连接酶连接制备一对Ogg1特异性锌指表达质粒；d.制备锌指编码mRNA：使用PmeI线性化锌指表达质粒，通过QIA快速PCR纯化试剂盒纯化；使用mMessage mMachine T7试剂盒进行合成 mRNA；再利用上述的RNA反应体系进行PolyA尾巴加合反应，37℃, 反应1h，纯化后，保存于‑80℃，可获得高表达效率的mRNA；e.胚胎注射与筛选鉴定：将所得锌指编码mRNA注射胚胎卵黄内，转移至斑马鱼孵育系统，完成构建。