[发明专利]定量湖泊沉积物中氨氧化古菌的方法

摘要

定量湖泊沉积物中氨氧化古菌的方法，包括DNA的提取、氨氧化古菌质粒标准品的构建及样品分析、得到扩增标准曲线后通过检测未知样品的Ct值对照标准曲线，检测出未知样品中氨氧化古菌的拷贝数。本发明应用实时荧光定量PCR技术定量检测湖泊沉积物中的氨氧化古菌，为研究湖泊沉积物中的氮循环机理提供了一种快速、简便、准确的研究方法。

主权项

定量湖泊沉积物中氨氧化古菌的方法，其特征在于步骤为：a.DNA的提取: 采集湖泊沉积物样品并进行冷冻干燥，称取5 g冻干之后的沉积物样品放入50 mL离心管中，应用CTAB化学裂解法提取沉积物总DNA，溶解于50 mL pH 8.0 TE缓冲液；氨氧化古菌质粒标准品的构建及样品分析: 通过氨氧化古菌特异性引物Arch‑amoAF和Arch‑amoAR对提取得到的DNA进行扩增，扩增反应体系为50 mL，包含10×PCR缓冲液5 mL，2.5 mM Mg2+ 4 mL，4 mL dNTPs ，各2.5 mM，上下游引物10 mM各1 mL，Taq DNA聚合酶2 U；扩增反应程序为：94℃预变性5 min，94℃变性1 min，53℃退火1 min，72℃延伸1.5 min，共45个循环，最后在72℃延伸10 min；PCR扩增产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，并用Axygen凝胶回收试剂盒进行切胶纯化，纯化后的产物与Promega公司的pGEM T‑Easy载体在4℃连接过夜；连接产物转化至感受态细胞DH5a并涂平板培养过夜；在平板上挑取白色单克隆菌落用LB培养基进行扩大培养，用Axygen的小量质粒提取试剂盒提取质粒，经PCR验证后在紫外分光光度计上测定其浓度并换算为氨氧化古菌的拷贝数，‑20℃保存备用;b.将已计算出拷贝数的氨氧化古菌质粒DNA按照10倍梯度进行稀释，使其浓度在102~107 copies/mL之间，取1 mL稀释产物作为模板加入20 mL定量PCR扩增体系，在Rotor‑Gene定量PCR仪上进行扩增反应，得到扩增标准曲线；20 mL扩增反应体系包括：2×Premix Ex Taq 10 mL，上下游引物各0.8 mL，DNA模板1 mL；PCR循环条件：95℃预变性3 min，94℃变性30 s，53℃退火60 s，72℃延伸20 s，共45个循环；待检测样品与标准曲线同步操作，扩增体系及扩增程序与建立标准曲线一致；通过检测未知样品的Ct值对照标准曲线，检测出未知样品中氨氧化古菌的拷贝数。