[发明专利]半滑舌鳎精巢细胞系的构建与鉴定方法

摘要

本发明涉及一种半滑舌鳎精巢细胞系的构建与鉴定方法，采用MEM基础培养基添加20％的胎牛血清、0.1％的β-巯基乙醇、2ng/ml人碱性成纤维细胞生长因子、1ng/ml白血病抑制因子、1nmol的丙酮酸钠、1nmol的谷氨酰胺，配制成完全培养基，将组织块接种在培养瓶中，翻瓶倒置培养3h，待组织块贴壁后再正置培养瓶使组织块浸泡在培养基中培养。采用胰酶消化方法进行细胞的传代培养。采用上述方法建立半滑舌鳎精巢细胞系1个，已传代培养至第50代，同时本发明还提供了所构建细胞系的染色体和分子标记水平的鉴定方法，以及该细胞系对相关病毒敏感性的鉴定方法。本发明建立的半滑舌鳎精巢细胞系的构建方法可以应用于其它鱼类性腺细胞培养和细胞系建立，具有较为广泛的推广应用前景。

主权项

一种半滑舌鳎精巢细胞系的构建方法，其特征在于它的方法，包括：配制细胞完全培养基、精巢细胞原代培养和传代培养；1)、配制细胞完全培养基：将市售GIBCO标准MEM培养基溶解为1000ml，然后加入2.38g Hepes缓冲剂，充分溶解、搅拌混匀后，调节pH在7.2‑7.5，过滤灭菌后，作为基础培养基，4℃保存；使用前在基础培养基中加入占总体积15％‑20％的胎牛血清、占总体积0.1％的β‑巯基乙醇、2ng/ml人碱性成纤维细胞生长因子、1ng/ml白血病抑制因子、1nmol的丙酮酸钠和1nmol的谷氨酰胺，配制成完全培养基；2)精巢细胞原代培养：取体重为250g左右的2龄雄鱼精巢置于直径为3.5cm的一次性无菌培养皿中，PBS冲洗一次，70％酒精浸泡3min，PBS冲洗两次；将精巢组织剪成小于1mm3的小块，在小组织块上滴加1‑2滴完全培养基，用无菌的200ul移液器吸头轻轻吸取组织块，接种在底面积为25cm2的培养瓶中，在培养瓶底均匀接种25‑30个1mm3的小组织块，将培养瓶翻转，使底部朝上，加入完全培养基2ml，倒置于23‑25℃的培养箱中培养；3h后，当组织块贴紧培养瓶壁时，轻轻翻转培养瓶，将培养瓶正置，轻晃培养瓶，使各组织块浸到培养液中；24h后补加完全培养基至4ml，补加时避免将刚贴壁的组织块吹起；隔天观察细胞贴壁及生长状态，每隔5天更换完全培养基的2/3，每次更换时吸出脱壁的组织块；3)传代培养：原代培养细胞开始增殖后，以组织块为中心形成细胞集落，各个组织块间的细胞集落相互接触相连，细胞数目增多，从而使整个瓶底细胞连成单层的一片，以0.25％的胰酶溶液消化贴壁细胞，消化1‑2min后吸出胰酶溶液，加入完全培养基；用1ml移液器轻轻吹打，使细胞悬浮，以一分为二的比例进行传代；根据细胞生长状态，3‑5天传代一次。