[发明专利]一种抑制口蹄疫病毒增殖的猪IFITM3基因及构建方法和应用

摘要

本发明公开了一种抑制口蹄疫病毒增殖的猪IFITM3基因及构建方法和应用，其步骤A、猪IFITM3基因的合成：设计引物，提取猪的淋巴结组织RNA，进行RT-PCR扩增sIFITM3基因，扩增，利用pCA-sIFITM3转染BHK-21细胞，通过共聚焦显微镜观察该蛋白表达于细胞膜；B、表达sIFITM3基因的慢病毒的构建以及纯化；C、稳定表达sIFITM3基因的BHK21-sIFITM3eGFP细胞系的构建：构建稳定表达sIFITM3的BHK-21细胞系，利用Lentivirus-sIFITM3eGFP和LentiviruseGFP分别转导BHK-21细胞，通过绿荧光进行克隆筛选，通过RT-PCR和Westernblotting鉴定sIFITM3的表达，为BHK21-sIFITM3eGFP。该基因、细胞系BHK21-sIFITM3eGFP、慢病毒Lentivirus-sIFITM3和真核质粒pCA-sIFITM3在制备治疗或预防口蹄疫病毒药物中的应用。构建的BHK21-sIFITM3eGFP细胞系能稳定表达sIFITM3蛋白、BHK21-sIFITM3eGFP能够抑制口蹄疫病毒复制、携带sIFITM3基因的慢病毒lentivirus-sIFITM3和真核质粒pCA-sIFITM3在机体水平能够抑制口蹄疫病毒复制。

主权项

一种抑制口蹄疫病毒增殖的猪IFITM3基因的制备方法，其步骤是A、猪IFITM3基因的合成：设计引物，提取猪的淋巴结组织RNA，进行RT‑PCR扩增sIFITM3基因，其引物序列如下：sIFITM 3F：  5’‑tttgaattccaccatgaactgcgct ‑3’；sIFITM 3R：  5’‑tttctcgagtcagatcatcgga ‑3’；利用两步法进行扩增，首先反转录得到cDNA，模板进行PCR扩增，其反应体系为：模板质粒0.25μL，1 0×LA buffer 5μL，pTRIM25F、pTRIM25R引物各1.0μL，LA 酶 0.25μL，dNTPS 1.0μL，加ddH2O 至50μL，按94℃作用3分钟；然后94℃作用30秒分钟， 58℃退火30秒，72℃延伸3分钟，共35个循环，最后72℃延伸10分钟的反应条件在PCR仪上进行扩增，扩增的PCR产物经0.8%g/v的琼脂糖凝胶电泳分析，一条大小438bp片段；通过XbaI和XhoI将sIFITM3亚克隆于的真核表达载体pCA中，获得载体pCA‑sIFITM3，大小为5151bp，转化大肠杆菌DH‑5α,置‑80℃保存，利用pCA‑sIFITM3转染BHK‑21细胞，通过共聚焦显微镜观察该蛋白表达于细胞膜；B、表达sIFITM3基因的慢病毒的构建以及纯化：sIFITM3基因在哺乳动物细胞中表达，慢病毒对分裂细胞和非分裂细胞均有感染，将外源基因整合到宿主染色体上，在细胞机体细胞上持久稳定地表达，利用ViraPowerTM HiPerformTM Lentiviral Expression Systems来建立携带sIFITM3基因的慢病毒，获得表达sIFITM3的慢病毒Lentivirus, 首先通过XbaⅠ和XhoⅠ酶将sIFITM3亚克隆入慢病毒转移载体pLentiV7.3/V5‑TOPO相应位点，构建质粒pLV7.3‑sIFITM3，构建稳定表达sIFITM3的细胞系，通过XhoⅠ和XmaI将绿荧光蛋白基因eGFP置于sIFITM3的下游进行，构建质粒pLV7.3‑sIFITM3eGFP，然后与慢病毒包装质粒pLP1、pLP2和pLP/VSVG，通过脂质体法Lipofectamine 2000 共转染293ft细胞，存在VSVG，转染后48h通过显微镜观察到典型的细胞融合，72h后收集上清，同时补加生长液，12h后再次收集上清液，获得HIV假型病毒，为Lentivirus‑ sIFITM3eGFP，用同样的方法将eGFP亚克隆于pLentiV7.3/V5‑TOPO获得转移质粒pLV7.3‑eGFP与包装质粒pLP1、pLP2和pLP/VSVG共转染293ft细胞获得慢病毒Lentivirus‑eGFP；将收集的上清液2000rpm/min离心5分钟，通过0.45μm的滤膜，过滤之后进行超速离心，获得慢病毒Lentivirus‑ sIFITM3eGFP和Lentivirus‑eGFP；C、稳定表达sIFITM3基因的BHK21‑sIFITM3eGFP细胞系的构建：构建稳定表达sIFITM3的BHK‑21细胞系，利用Lentivirus‑sIFITM3eGFP和LentiviruseGFP分别转导BHK‑21细胞，通过绿荧光进行克隆筛选，通过RT‑PCR和Western blotting鉴定sIFITM3的表达，为BHK21‑ sIFITM3eGFP。