[发明专利]一种植物不育系和恢复系的制备方法和应用

摘要

本发明公开了一种植物不育系和恢复系的制备方法和应用，其步骤是：A：人工创建不育系的引物设计；B：不育系的制备：以拟南芥DNA为模板，进行第一和第二个干扰片段的扩增，构建干扰载体，并通过农杆菌转化转化拟南芥，获得的阳性不育植株即为人工创建的不育系。C、人工创建恢复系的引物设计；D：恢复系的制备：以油菜DNA为模板进行PBnPABP5启动子扩增，以油菜花蕾cDNA为模板进行BnPABP5基因扩增，用获得的PBnPABP5启动子序列和BnPABP5基因序列分别替换pBI121植物表达载体中的CaMV35S序列和GUS序列，构建PBnPABP5驱动的BnPABP5的植物过表达载体，进行拟南芥植株的转化，获得阳性植株，该植株即为人工创建的恢复系。不育系和恢复系在油菜杂交制种中的应用，实现杂交育种过程中的三系配套。

主权项

一种植物恢复系的制备方法，其步骤是：A：人工创建恢复系的引物设计：利用SDS裂解法提取油菜DNA，以DNA为模板，进行PBnPABP5启动子的扩增，引物为：PBnPABP5A，GACATCTAGACGCTGTCGTTGGGGCAATTC； PBnPABP5S，CAGAAGCTTAAAAGACTTACCGAGTTGAACC；利用Trirol进行油菜花蕾RNA的提取，以RNA反转录的cDNA为模板进行BnPABP5基因的扩增，引物为：BnPABP5A， GACGAGCTC TCACTCCGTTGAGGAGGG； BnPABP5S，GACATCTAGAATGGTTGATCAAGTCATCCC；B：恢复系的制备：以油菜DNA为模板进行PBnPABP5启动子PCR扩增，引物为PBnPABP5A和PBnPABP5S，反应体系为25 μL内含:1×PCR buffer, MgCI 1.5 mmol/L，dNTP 0.2 mmol/L、引物浓度为0.5 mol/L，Pfu酶1.5单位，模板100ng，PCR反应程序：94℃ 5 min；94℃ 30 sec，55℃ 45 sec，72℃ 1 min，32个循环；72°C延伸8 min，反应完成后用凝胶回收试剂盒回收并纯化目的片段，获得PBnPABP5启动子序列，以油菜花蕾cDNA为模板进行BnPABP5基因的PCR扩增，引物为BnPABP5A和BnPABP5S，反应体系同PBnPABP5启动子的扩增，PCR反应程序：94℃ 5 min；94℃ 30 sec，55℃ 45 sec，72℃ 1 min，32个循环；72°C延伸8 min，完成后用凝胶回收试剂盒回收纯化目的片段，获得BnPABP5基因序列，用获得的PBnPABP5启动子序列和BnPABP5基因序列分别替换pBI121植物表达载体中的CaMV35S序列和GUS序列，构建PBnPABP5驱动的PABP5基因的植物过表达载体，进行拟南芥植株的转化，获得阳性植株，该阳性植株即为人工创建的恢复系。