[发明专利]一种基于次生体胚发生的橡胶树高效遗传转化方法

摘要

本发明公开了一种基于次生体胚发生的橡胶树高效遗传转化方法，其特征在于包括遗传转化受体—体细胞胚状体的获得、体细胞胚状体的遗传转化、转化胚状体的增殖、转化胚状体的植株再生和转化植株的移栽过程。本发明操作简单，效率高，有效避免了传统遗传转化不断采集花序、消毒、诱导愈伤的重复、低效、繁重的体力劳动，以及遗传转化受体获得受天气和季节等环境因素的影响，同时充分利用了次生体胚发生能够高效获得胚状体及体胚能够循环增殖的特点，克服了传统方法转化胚状体和转化植株获得效率低的缺陷，极大地提高了橡胶树遗传转化效率，对橡胶树转基因育种、基因的功能验证具有重要的技术支撑作用。

主权项

一种基于次生体胚发生的橡胶树高效遗传转化方法，其特征在于：包括遗传转化受体 体细胞胚状体的获得、体细胞胚状体的遗传转化、转化胚状体的增殖、转化胚状体的植株再生和转化植株的移栽五个步骤：(a)遗传转化受体 体细胞胚状体的获得：挑选健壮、生命力旺盛的胚状体，将其从原有培养基分离出来作为转化受体；(b)体细胞胚状体的遗传转化：其过程包括侵染、共培养、恢复培养、愈伤诱导和分化过程；侵染：OD600＝0.1 0.6农杆菌侵染3 10min，置无菌滤纸吸干菌液；共培养：侵染后的胚状体转入添加1 50mg/L硝酸银的愈伤诱导培养基上，其PH值为5.2，20 28℃共培养3 6天；恢复培养：共培养后的胚状体转入添加1 50mg/L硝酸银和抑制农杆菌生长抗生素的愈伤诱导培养基上，其PH值为5.8，23 28℃暗培养3 10天；愈伤诱导：将恢复培养后的胚状体切成0.2 0.5×0.2 0.5cm的胚块，然后转入添加了1 50mg/L硝酸银，抑制农杆菌生长的抗生素和相应筛选剂的愈伤诱导培养基上，其PH值为5.8，23 28℃暗培养15 40天；分化：将愈伤化的胚块转入添加抑制农杆菌生长的抗生素和相应筛选剂的分化培养基，其PH值为5.8，23 28℃暗培养30 70天；(c)转化胚状体的增殖：将GUS染色阳性的胚状体切成0.2 0.5×0.2 0.5cm的胚块，重复步骤(b)所述愈伤诱导、分化过程，但去除愈伤诱导所用培养基的硝酸银；此过程可循环，直至转化子获得足够的成熟子叶形胚状体；循环1 3次后，抑菌抗生素可去除；(d)转化胚状体的植株再生：将成熟的子叶形胚状体转到出苗培养基，其PH值为5.8，23 28℃光照培养，20 60天出苗；(e)转化植株的移栽：(1)芽接：以再生的转化植株作为接穗，籽苗或组培苗作为砧木，通过芽接、解绑、装袋一系列过程实现从实验室到大田的移栽；(2)沙床移栽：将再生的转化植株洗净培养基后移入沙床，控制温度、湿度、病害，半个月后逐渐掀棚，一个月转化植株抽出新芽、长出新根，待叶片长至稳定期后装袋。